不同脂肪酸組成的油脂對LPS誘導的小鼠腸道炎癥的影響

趙 曉，張 永，張新勝，徐 慶，于曉明，李惠子，楊雪艷，劉英華*，薛長勇*

(1解放軍總醫院營養科，北京 100853；2火箭軍總醫院營養科，北京 100853)

不同脂肪酸組成的油脂對LPS誘導的小鼠腸道炎癥的影響

趙 曉1，張 永1，張新勝1，徐 慶1，于曉明1，李惠子2，楊雪艷1，劉英華1*，薛長勇1*

(1解放軍總醫院營養科，北京 100853；2火箭軍總醫院營養科，北京 100853)

目的：比較不同脂肪酸組成的油脂對LPS誘導的小鼠腸道急性炎癥的影響，為重癥腸道感染提供腸內營養的數據參考。方法：取12w齡雄性C57BL/6J小鼠40只，腹腔注射LPS(3.5mg/kg)24h后，測量空腹體重，隨機分為5組：玉米油組(ω-6脂肪酸)、橄欖油組(ω-9脂肪酸)、紫蘇油組(ω-3脂肪酸)、中長鏈油組(中鏈脂肪酸)、LPS損傷組(灌胃葡萄糖)。根據組別灌胃小鼠，7d后取小鼠腹主動脈血及小腸組織，測定細胞因子水平和TLR4信號通路中相關分子的mRNA表達，并進行小腸組織病理切片觀察。研究期間每日測量小鼠體重。結果：研究結束時，各組小鼠體重均升高，以橄欖油組和紫蘇油組最高，且與LPS損傷組和玉米油組比較均有顯著性差異(P<0.05)；血和小腸中TNF-α、IL-1β、IL-6水平及小腸TLR4、MyD88和TNF-α的mRNA表達以中長鏈油組最低，與LPS損傷組和玉米油組比較均有顯著性差異(P<0.05)，而與橄欖油組和紫蘇油組無顯著性差異(P>0.05)。小腸組織病理切片結果顯示：各組小鼠小腸粘膜均有不同程度的損傷，以LPS損傷組損傷最明顯，玉米油組次之，橄欖油組處于中等水平，中長鏈油組與紫蘇油組損傷較輕。結論：中鏈脂肪酸、ω-3脂肪酸和ω-9脂肪酸來源的油脂對LPS誘導的腸道炎癥的修復作用均優于ω-6脂肪酸來源的油脂和葡萄糖，機制可能為抑制腸道TLR4信號傳導途徑相關因子表達，減少促炎細胞因子釋放。

脂肪酸；LPS；腸粘膜損傷；炎癥反應

重癥感染是全身性感染導致的以器官功能損害為特征的臨床綜合征[1]，其中，腸道炎癥是重癥感染的主要表現。當機體遭受嚴重創傷、休克、腸缺血以及嚴重感染等重癥應激狀態時，大量腸道細菌移位導致腸上皮細胞損傷，并激活一系列免疫反應，導致炎癥介質大量產生和釋放，引發腸道炎癥甚至全身炎癥反應。適時和恰當地應用腸內營養不僅能有效改善患者的營養狀況，還可以有效改善腸粘膜損傷[2-3]，其可能通過加速緩解腸道炎癥來實現。本課題組前期研究結果顯示中鏈脂肪酸和ω-3脂肪酸可以有效降低肥胖小鼠小腸組織炎癥因子水平及Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)傳導通路中相關蛋白的表達。但針對腸道感染狀態下不同脂肪酸來源的油脂是否可以通過TLR4傳導通路減輕腸道炎癥反應并改善腸功能尚有待進一步研究。此外，有關重癥研究多集中在腸外營養。故本次研究擬通過觀察不同脂肪酸組成的油脂對腸道炎癥的影響，為重癥腸道感染患者實施腸內營養治療時選擇何種脂肪來源的腸內營養制劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型的建立及分組

SPF級健康12w齡雄性C57BL/6J小鼠，由中國醫學科學院實驗動物研究所提供，生產許可證號為SCXK(京)2014-0004，使用許可證號為SYXK(軍)2012-0010。小鼠由普通飼料適應性喂養1w后，按5、4.5、4、3.5、3、2.5mg/kg的劑量腹腔注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)。每日測量體重，選擇第2d體重下降>5%且3d內不死亡的最低劑量作為實驗研究用劑量，為3.5mg/kg。另購買40只12w齡雄性C57BL/6J小鼠，腹腔注射3.5mg/kg LPS 24h后，測量空腹體重，隨機分為5組，每組8只小鼠：玉米油組(ω-6脂肪酸)、橄欖油組(ω-9脂肪酸)、紫蘇油組(ω-3脂肪酸)、中長鏈油組(中鏈脂肪酸)、LPS損傷組。5組小鼠分別灌胃玉米油(100μL/d)、橄欖油(100μL/d)、紫蘇油(100μL/d)、中長鏈油(100μL/d)、葡萄糖(200μL/d、濃度為1g/mL)，連續灌胃7d，研究期間仍以普通飼料繼續喂養。

1.2 主要試劑及引物

紫蘇油，由上海益壽金生物制品有限公司提供；中長鏈油，由日清奧利友(中國)投資有限公司提供；玉米油、橄欖油，分別購自中糧品牌和歐麗薇蘭品牌；LPS(Escherichia coli 026：B6)，購自美國Sigma公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒(Cat.No.23225)，購自美國Pierce公司；腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、白細胞介素-6(IL-6)、ELISA試劑盒(Cat.No.MCYTOMAG-70K-PMX)，購自德國Merck公司；核糖核酸(RNA)提取試劑盒、逆轉錄-PCR(RT-PCR)試劑盒，購自美國Promega 公司；TLR4抗體(ab13556)、髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88，MyD88)抗體(ab2064)、TNF-α抗體(ab6671)，均購自美國Abcam公司；Trizol、M-MLV 逆轉錄酶，購自美國Invitrogen 公司；其他試劑為進口分析純試劑。引物合成由北京奧科鼎盛生物科技有限公司提供，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 動物體重及血、小腸組織的處理 研究期間每日固定時間點測量小鼠體質量并記錄。各組灌胃7d后處死小鼠，經腹主動脈采集血樣，3 000～4 000 r/min離心，取血清儲存于-80℃，待ELISA試劑盒檢測相關炎癥因子水平。分離出全部小腸組織，共分3部分：第一部分立即放于液氮中備檢mRNA；第二部分用0.9% 氯化鈉注射液按10% 濃度制成勻漿，700 r/min 離心15 min，取上清液，凍存于液氮中，待ELISA試劑盒檢測炎癥因子水平；第三部分小腸組織用蒸餾水漂洗后，浸泡于多聚甲醛中進行固定，待進行病理切片觀察。

1.3.2 血和小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平測定 取凍存的血清和小腸組織上清液，運用BCA法測定小腸組織蛋白濃度，再根據ELISA 檢測試劑盒說明分別檢測血清和小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

1.3.3 小腸組織中TLR4、MyD88和TNF-α的mRNA表達測定 每個小腸組織樣本約100mg，首先按Trizol 試劑的操作說明進行RNA提取，以總RNA 3 μg為逆轉錄反應模板，采用隨機引物，按照反轉錄試劑盒的操作步驟說明在普通PCR 儀上進行逆轉錄，再以2 μL逆轉錄反應產物為模板，按照熒光實時定量PCR (real-time RT-PCR)試劑盒說明書，冰上配置50 μL的PCR 反應體系，進行小腸組織中mRNA表達測定。實時定量PCR 擴增條件為：95 ℃預變性120 s，95 ℃變性20 s，59 ℃退火25 s，72 ℃延伸30 s，45 個循環。目的基因表達采用Ct (threshold cycle，Ct)值法，以各樣本基因的Ct值與其相應內參照β-actin基因的Ct值之差(ΔCt)來表示，表示方法為2- ΔΔ Ct，即為2Δ Ct(actin)-Δ Ct(target gene)。

1.3.4 小腸組織病理標本處理及染色 將固定的小腸組織進行常規石蠟包埋、切片，切片厚度為2 μm，行HE染色后于光鏡下觀察組織病理學改變。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 小鼠模型建立、分組及體重變化情況

實驗開始時小鼠體重為28.44±1.01g，腹腔注射3.5mg/kg LPS 24h后體重為26.43±1.45g，體重下降百分比為7.1%，存活率100%。按空腹體重隨機分為5組，經不同油脂灌胃干預1w后，各組小鼠體重均升高，橄欖油、紫蘇油組和中長鏈油組體重增長顯著高于LPS損傷組和玉米油組(P<0.05)，其中，紫蘇油組和橄欖油組體重增長值較高，但與中長鏈油組差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 小鼠體質量變化趨勢注：*與玉米油組比較，P<0.05；#與LPS損傷組比較，P<0.05

2.2 不同脂肪酸組成的油脂對小鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響

橄欖油組、紫蘇油組和中長鏈油組小鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著低于玉米油組、LPS損傷組(P<0.05)，其中，以中長鏈油組因子水平最低(表2)。

表2 小鼠血中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

注：*與玉米油組比較，P<0.05；#與LPS損傷組比較，P<0.05

2.3 不同脂肪酸組成的油脂對小鼠小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及TLR4、MyD88和TNF-α mRNA表達的影響

橄欖油組、紫蘇油組和中長鏈油組小鼠小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平以及TLR4、MyD88和TNF-αmRNA表達均顯著低于玉米油組、LPS損傷組(P<0.05)，其中，以中長鏈油組因子水平最低(表3、圖2)。

表3 小鼠小腸組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平

注：*與玉米油組比較，P<0.05；#與LPS損傷組比較，P<0.05

圖2 小鼠小腸組織中TLR4、MyD88、TNF-α mRNA表達注：*與玉米油組比較，P<0.05；#與LPS損傷組比較，P<0.05

2.4 不同脂肪酸來源油脂對小鼠小腸病理切片影響

各組小鼠小腸粘膜均有不同程度的損傷，以LPS損傷組損傷最明顯，玉米油組次之，橄欖油組小腸粘膜損傷處于中等水平，中長鏈油組與紫蘇油組未見明顯異常(圖3)。

3 討論

腸道作為人體最大的消化器官和免疫器官，其正常粘膜屏障作用的維持有賴于腸粘膜連續性的完整和正常的腸粘膜支持系統，眾多應激因素和感染的存在可能使兩者發生異常，從而導致腸粘膜屏障的損傷，促發系統性炎癥反應。因此，改善與維持腸粘膜屏障功能是多種疾病尤其是重癥感染治療中的重要保證。多項研究結果證明，腸內營養可有效改善腸粘膜屏障功能，改善腸粘膜損傷[4]。腸內營養不但能直接供給營養，還具有較腸外營養更優越的地方，如促使腸蠕動功能的恢復、加速門靜脈系統的血液循環、促進胃腸道激素的分泌等。本次研究結果顯示，LPS損傷建立小鼠腸道感染模型后，無論是灌胃葡萄糖還是灌胃不同脂肪酸組成的油脂，小鼠體重都有不同程度的升高，說明腸內營養對重癥感染的恢復具有一定的促進作用。

機體在重癥應激狀態下，會出現細菌移位和內毒素血癥，進一步加劇腸上皮細胞的損傷并刺激腸粘膜免疫細胞，激活細胞內一系列的免疫反應，導致大量炎癥介質如TNF-α、IL-6等的產生和釋放。TLR4在先天性免疫反應的炎癥信號通路中具有重要作用，其通過識別病原相關分子模式的特有抗原成分而進行信號識別和傳導。革蘭氏陰性細菌的細胞壁成分脂多糖LPS是TLR4最重要的配體[5]，通過結合CD14、LBP、TLR4形成受體復合物，與MyD88結合觸發下游信號級聯反應，最終激活NF-κB，加劇促炎因子和COX2的釋放[6]。在這樣的背景下，本次研究旨在針對腸道感染狀態下，不同脂肪酸來源的油脂是否可以通過TLR4傳導通路減輕炎癥反應以改善腸功能。研究結果顯示，中鏈脂肪酸、ω-3脂肪酸和ω-9脂肪酸來源的油脂的干預可以在短期內有效降低小腸炎癥水平，改善腸粘膜損傷，并抑制TLR4信號通路相關蛋白的表達，說明這3種油脂干預對LPS誘導的體重減輕和炎癥反應的有益作用要優于葡萄糖和ω-6脂肪酸來源的油脂，機制可能與TLR4信號通路的抑制有關。

圖3 不同脂肪酸來源的油脂組小腸病理切片(×100)

我們課題組前期進行過ω-3多不飽和脂肪酸(PUFA)干預可以改善LPS誘導的小鼠體重降低的研究[7]；同時進行過MCFA可以有效降低肥胖小鼠的小腸炎癥水平的實驗。以往也有研究結果顯示，ω-9單不飽和脂肪酸可以有效減少機體的氧化應激損傷和炎癥反應[8]。為此，本實驗將三種脂肪酸來源的油脂與常用的ω-6脂肪酸來源的油脂及葡萄糖進行對比，結果顯示：中鏈脂肪酸、ω-3脂肪酸和ω-9脂肪酸來源的油脂對LPS誘導的腸道炎癥的修復作用較好，以MCFA效果最佳，提示其作為腸內營養制劑的組成成分將有助于改善重癥腸道感染患者疾病狀況。但其以何種比例進行腸內營養可以達到更好的效果還有待進一步研究。◇

[1]潘純，楊毅，邱海波.重癥感染的早期診斷和治療[J].實用醫院臨床雜志，2012，9(6)：1-4.

[2]黎介壽.腸內營養—外科臨床營養支持的首選途徑[J].中國實用外科雜志，2003，23(2)：67.

[3]李元新，黎介壽.腸內營養支持的進展[J].江蘇臨床醫學雜志，2002，6(2)：90.

[4]Ridley E，Gantner D，Pellegrino V.Nutrition therapy in critically ill patients - A review of current evidence for clinicians[J]. Clinical Nutrition.2015，34(4)：565-571.

[5]Gioannini TL，Weiss JP.Regulation of interactions of Gram-negative bacterial endotoxins with mammalian cells[J]. Immunol Res，2007，39(1-3)：249-260.

[6]Kang S，Lee SP，Kim KE，et al.Toll-like receptor4 in lymphatic endothelial cells comtributes to LPS-induced lymphangiogenesis by chemotactic recruitment of macrophages [J].Blood，2009，113(11)：2605-2613.

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[8]王新穎，潘莉雅，李維勤，等.n-9單不飽和脂肪酸減輕危重病人的氧化應激和過度炎癥反應[J].腸外與腸內營養，2010，17(6)：323-325.

(責任編輯 李婷婷)

Effects of Oil Composed of Different Fatty Acids on Intestinal Inflammation Induced by LPS in C57BL/6J Mice

ZHAO Xiao1，ZHANG Yong1，ZHANG Xin-sheng1，XU Qing1，YU Xiao-ming1，LI Hui-zi2，YANG Xue-yan1，LIU Ying-hua1，XUE Chang-yong1

(1Department of Nutrition，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China；2Department of Nutrition，The Rockets Army General Hospital of PLA，Beijing 100853，China)

fatty acid；LPS；intestinal mucosal injury；inflammation

國家自然科學基金(項目編號：81541067、81202203)；解放軍總醫院科技創新苗圃基金(項目編號：15KMM45)。

趙曉(1991— )，女，在讀碩士，研究方向：臨床營養與脂代謝。

*共同通信作者：劉英華(1977— )，女，博士，副主任醫師，副教授，研究方向：臨床營養；薛長勇(1962— )，男，碩士，主任醫師，教授，研究方向：臨床營養與脂代謝。