高效液相色譜法測定蔬菜中β-胡蘿卜素的不確定度評定

王曉婧，曹夢錦，張雪松，王國棟，王 竹

(中國疾病預防控制中心營養與健康所/國家衛生和計劃生育委員會微量元素重點實驗室，北京 100050)

高效液相色譜法測定蔬菜中β-胡蘿卜素的不確定度評定

王曉婧，曹夢錦，張雪松，王國棟，王 竹

(中國疾病預防控制中心營養與健康所/國家衛生和計劃生育委員會微量元素重點實驗室，北京 100050)

建立高效液相色譜法測定蔬菜中β-胡蘿卜素的不確定度評定數學模型，計算β-胡蘿卜素測量結果的不確定度。胡蘿卜和菠菜中β-胡蘿卜素的擴展不確定分別為0.684和0.444 mg/100g(k=2、P=95%)。影響β-胡蘿卜素HPLC法測定的不確定度來源主要是樣品均勻性、前處理過程及HPLC儀器定量重復性，不確定度評定有利于完善測定結果的準確性。

不確定度；β-胡蘿卜素；蔬菜；高效液相色譜法

β-胡蘿卜素由于其如顯著的維生素A原活性、抗氧化、防癌、利于心血管健康等而備受關注[1-3]。天然攝入的β-胡蘿卜素主要來源于植物性食物，其含量測定方法中高效液相色譜法(HPLC)因其準確度高、操作相對簡便，可將胡蘿卜素各單體物質分離并分別予以定性和定量的優點而成為β-胡蘿卜素分析的主流方法[4-7]。本研究組在《食品安全國家標準 食品中β-胡蘿卜素的測定》的標準整合過程中，為提高提取效率、改善色譜分離效果及增進β-胡蘿卜素結果的科學表達，提出了以下幾點改進之處：一是前處理過程中增加了低溫醇提步驟，有效提高胡蘿卜素的提取效率；二是在HPLC測定中采用C30Carotenoid色譜柱，將α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素及其順反異構體進行分離，從而實現分別計量；三是按照AOAC方法將β-胡蘿卜素的各順反式異構體分別定性定量并綜合評定β-胡蘿卜素的含量[9]，以避免造成結果的低估或偏估。本試驗根據JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[10]，對蔬菜中β-胡蘿卜素含量測定的不確定度進行了測量和評定，以期為評定測量結果提供參考。

1 材料與方法

1.1 測量所需材料與步驟

1.1.1 儀器與試劑 儀器與耗材：高效液相色譜儀(Waters 2 695，美國Waters公司)；紫外檢測器(Waters 2 487，美國Waters公司)；YMC Carotenoid C30色譜柱(3μm，4.6×150 mm)；紫外分光光度計(722G型，上海精科)；旋轉蒸發儀(RE-2010型，鞏義市京華儀器有限責任公司)；恒溫振蕩水浴鍋(SHZ-88，太倉市實驗設備廠)；分析天平(Mettler MS204S，瑞士梅特勒托利多公司)；所有玻璃器皿均為A級。

標準品與試劑：β-胡蘿卜素(CAS號：7235-40-7，純度>95%)，購于Sigma公司；甲醇為色譜級 (Fisher Scientific公司，批號152469)；乙腈為色譜級(Fisher Scientific公司，批號150942)；甲基叔丁基醚為色譜純(Fisher Scientific公司，批號147314)；二氯甲烷為色譜純(Fisher Scientific公司，批號148424)；正己烷為色譜純(Fisher Scientific公司，批號152474)；試驗用水為超純水(電阻率≥18.2MΩ·cm)。無水乙醇為優級純(北京化工廠，批號20150618)；石油醚(沸程30～60℃，北京化工廠，批號20151012)；氫氧化鉀(西隴化工股份有限公司，批號120716)；無水硫酸鈉(西隴化工股份有限公司，批號140913)；均為分析純。

1.1.2 測量步驟 (1)標準溶液的配制及標定：將β-胡蘿卜素標準品用二氯甲烷溶解，配制成濃度約500 μg/mL儲備液，分裝保存在-20℃冰箱內；試驗當日，取β-胡蘿卜素儲備液100 mL，加正己烷稀釋并定容至10 mL。以正己烷為空白，入射光波長為450 nm測定其吸光度值，平行測定3次，取均值，按式(1)計算標準液濃度。

(1)

式(1)中：CR為β-胡蘿卜素標準儲備液的標定濃度；A為β-胡蘿卜素的吸光度值；E為以正己烷為溶劑時β-胡蘿卜素的比吸光系數(0.262 0)；V2為定容體積(mL)；V1為移取標準儲備液的體積(mL)。

(2)全反式β-胡蘿卜素響應因子(RF)的測定：將β-胡蘿卜素儲備液稀釋為濃度約3 μg/mL的標準使用液，注入HPLC儀中，根據保留時間測定-胡蘿卜素各異構體峰面積，平行測定6次。全反式β-胡蘿卜素的色譜純度(CP)和響應因子(RF)分別按式(2)和式(3)計算：

(2)

(3)

式(2)和(3)中：CP為全反式β-胡蘿卜素的色譜純度；Rsum為標準使用液中β-胡蘿卜素各異構體(包括全反式β-胡蘿卜素、9-順式β-胡蘿卜素、13-順式β-胡蘿卜素、15-順式β-胡蘿卜素及其他順式結構)的峰面積總和；Rall-E為標準使用液中全反式β-胡蘿卜素的峰面積；R9Z為標準使用液中9-順式β-胡蘿卜素的峰面積；R13Z為標準使用液中13-順式β-胡蘿卜素的峰面積；R15Z為標準使用液中15-順式β-胡蘿卜素的峰面積；RxZ為標準使用液中其他順式β-胡蘿卜素的峰面積；Cr為β-胡蘿卜素標準使用液的濃度。

(3)樣品前處理：取勻質化的蔬菜樣品0.5～1 g(精確至0.001g)于100mL錐形瓶中，加入0.5 g抗壞血酸，30 mL無水乙醇，于60 ℃水浴振蕩30 min，后加入10 mL飽和氫氧化鉀溶液，蓋上瓶塞。置于已預熱至53℃恒溫振蕩水浴箱中，皂化30 min。取出，靜置，冷卻到室溫。將皂化液轉入250 mL分液漏斗中，加入50 mL石油醚，輕輕搖動，排氣，蓋好瓶塞，室溫下振蕩10 min后靜置分層，將水相轉入另一分液漏斗中按上述方法進行第二次提取。合并有機相，用水洗至近中性。棄水相，有機相通過無水硫酸鈉過濾脫水。濾液收入250 mL蒸發瓶中，于旋轉蒸發儀上40℃減壓濃縮，近干。用氮氣吹干，用移液管準確加入5.0 mL二氯甲烷，蓋上瓶塞，充分溶解提取物。經0.45 μm膜過濾后供液相色譜分析用。

(4)色譜條件：YMC Carotenoid C30色譜柱(4.6 mm×150 mm，3 μm)；流速1 mL/min；柱溫30℃；檢測波長450 nm；流動相為A(甲醇∶乙腈∶水73.5∶24.5∶2)、B(甲基叔丁基醚)，洗脫程序：100%～59% A線性變換(0～15 min)，59%～20% A線性變換(15～19 min)，20%～0% A線性變換(19～20 min)。根據保留時間和相對位置定性，通過計算各異構體的峰面積來定量。

1.2 測量數學模型的建立

本試驗中β-胡蘿卜素的計算公式為式(4)：

(4)

式(4)中：X為待測樣品中β-胡蘿卜素的含量(μg/100g)；S為待測液中β-胡蘿卜素各異構體經校正后的色譜峰總面積；V為試樣液定容體積(mL)；RF為全反式β-胡蘿卜素響應因子(計算方法見1.1.2)；m為試樣質量(g)；其中：S=Sall-E+S9Z+S13Z×1.2+S15Z×1.4+SxZ，Sall-E為待測液中全反式β-胡蘿卜素峰面積、S9Z為待測液中9-順式-β-胡蘿卜素的峰面積、S13Z為待測液中13-順式-β-胡蘿卜素的峰面積、S15Z為待測液中15-順式-β-胡蘿卜素的峰面積，SxZ為待測液中其他順式β-胡蘿卜素的峰面積，1.2和1.4分別為13-順式-β-胡蘿卜素和15-順式-β-胡蘿卜素的相對校正因子。

測量結果的不確定性除受到公式中S、V、RF和m的影響外，樣品均勻性和前處理過程的一致性都會對檢測結果產生影響，考慮其影響量，公式中需加入校正因子frep，式(4)則轉化為式(5)：

(5)

(6)

1.3 不確定度來源分析

蔬菜中β-胡蘿卜素測量結果的不確定度來源主要包括：標準儲備液的標定、標準溶液和樣品溶液稀釋定容過程中的玻璃量器、樣品的天平稱量、HPLC定量、樣品均勻性和前處理引入的不確定度等方面。

1.4 不確定度分量的評定方法

1.4.1 A類評定 由觀測列統計分布所作的不確定度評定，即對被測量進行獨立重復觀測，A類評定的標準不確定度以所得到的一系列測得值的試驗標準偏差表示。此類評定包括了測量過程中的各種隨機效應，包括樣品的均勻性和代表性、環境條件、儀器狀態、人員操作及前處理等導致的不確定度。

2 結果與分析

2.1 β-胡蘿卜素色譜峰總面積(S)的相對標準不確定度

2.2 全反式β-胡蘿卜素響應因子(RF)測定的相對標準不確定度

本試驗采用紫外-可見分光光度計(722G型)進行標定，其檢定證書顯示其相對擴展不確定度為0.5%，k=2，則相對標準不確定度為0.005/2=0.002 5。

2.2.3 HPLC測定引入的相對標準不確定度urel(LC) 計算方法見2.1。

2.3 樣品稱重(m)的相對標準不確定度

樣品稱重引入的不確定度由天平的最大允許誤差構成。稱重使用Mettler MS204S電子天平，其檢定證書給出稱量砝碼重量為10 mg時的擴展不確定度為0.002 mg，k=2，由天平稱量產生的相對標準不確定度為0.002/2/10=0.000 1。

2.4 樣品定容體積(V)的相對標準不確定度

2.5 樣品均勻性和樣品前處理過程中(frep)引入的不確定度

表1 測量重復性結果 單位：mg/100g

表2 加標回收率實驗及前處理引入的不確定評定

2.6 合成標準不確定度 urel(X)

將表3中各種相對標準不確定度按照式(6)合成，可以得到兩種蔬菜中β-胡蘿卜素含量測量結果的合成相對標準不確定度及合成標準不確定度。

表3 兩種蔬菜樣品中β-胡蘿卜素不確定度來源及合成標準不確定度

2.7 擴展不確定度及測量結果

依據標準JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[10]，對大多數測量不確定評估，取置信水平95%，k=2，則擴展不確定度為 U(X)= 2×uc(X) 。測得胡蘿卜中β-胡蘿卜素的含量及不確定度為5.68 mg/100g (U =0.684 mg/100g，k=2)，菠菜中β-胡蘿卜素的含量及不確定度為3.00 mg/100g (U =0.444 mg/100g，k=2)。

3 討論

本試驗以富含β-胡蘿卜素的胡蘿卜和菠菜為代表，評估了HPLC法測量β-胡蘿卜素含量的不確定度，得出影響測量結果的不確定度的主要來源為HPLC儀器測量重復性、樣品測量重復性及前處理過程。前者引入的不確定度由方法本身決定，主要體現在全反式β-胡蘿卜素的響應因子RF的測定和樣品結果測量過程中均需要計入4種順反式異構體的峰面積。因此今后在使用HPLC法測量β-胡蘿卜素含量時，根據不確定度分量加強準確測量，應注意以下幾點：(1)減少前處理及其他隨機過程引入的系統誤差，注意取樣的均勻性、代表性，保證操作規范和一致，平行測量；(2)定期對儀器進行期間核查和維護保養，以保證儀器的穩定性；(3)將標準儲備液制備得到標準使用液過程中，經歷了兩次稀釋步驟，增加了不確定度來源，可考慮將制備得的標準使用液再次標定，將標定所得的標準使用液濃度Cr代入計算，減少測定結果的不確定度。從本試驗研究結果來看，不確定度評價不僅可用于評估測量方法的可靠性和測量結果的可信程度，而且可以通過分析測量過程的主要誤差來源完善方法的準確性。◇

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(責任編輯 劉宏)

Uncertainty Evaluation on Determination ofβ-carotene in Vegetables by HPLC

WANG Xiao-jing，CAO Meng-jin，ZHANG Xue-song，WANG Guo-dong，WANG Zhu

(National Institute for Nutrition and health，CDC/Key Laboratory of Trace Element Nutrition，National Health and Family Planning Commission of the People’s Republic of China，Beijing 100050，China)

A mathematical model was established for determiningβ-carotene in vegetables by HPLC and the measurement uncertainty was evaluated.The expand uncertainties ofβ-carotene were 0.684 mg/100g (k=2，P=95%，for carrot)and 0.444 mg/100g (k=2，P=95%，for spinach)，respectively.The uncertainty from sample uniformity，pretreatment and HPLC instrument were the main sources of uncertainty and uncertainty evaluation was helpful to promote the accuracy of measurement.

uncertainty；β-carotene；vegetable；high performance liquid chromatography (HPLC)

“十二五”國家科技支撐項目“功能食品資源優化和評價共性關鍵技術研究”(項目編號：2012BAD33B01)；衛計委標準司“國家食品安全標準 食品中β-胡蘿卜素的測定方法研究”。

王曉婧(1985— )，女，博士，助理研究員，研究方向：食物營養。

王竹(1970— )，女，博士，研究員，研究方向：食物營養。