探討GABAARG2基因在癲癇耐藥機制中的作用

戚 玲， 李佩云， 邢冬梅， 賈 帆

探討GABAARG2基因在癲癇耐藥機制中的作用

戚 玲， 李佩云， 邢冬梅， 賈 帆

目的 探討癲癇患者中GABAARG2基因與耐藥性癲癇的關系。方法 選擇來本院就診的98例癲癇患者，根據對抗癲癇藥物的反應性分為耐藥組(觀察組)46例和敏感組(對照組)52例進行研究，提取所有患者的DNA，采用PCR基因測序鑒定GABAARG2基因出現的概率，對每一位受試者以口服傳統的抗癲癇藥物-苯妥英(phenytoin)方式來對比兩組患者的藥物口服吸收率。結果 觀察組和對照組之間的年齡、性別、既往病史、持續狀態方面差異均無統計學意義(P>0.05)。觀察組出現GABAARG2基因的概率顯著高于對照組，差異具有統計學意義(χ2=8.08，P=0.01)；觀察組的總體口服吸收率(68.71%±12.28%)明顯低于對照組的口服吸收率(82.36%±15.31%)，差異具有統計學意義(χ2=6.78，P=0.01)。結論 GABAARG2基因的在腦內的出現會影響抗癲癇藥物的效果，進而引起患者的耐藥性，對臨床治療有較好的參考價值。

GABAARG2基因； 苯妥英； 耐藥性癲癇； 多形性

癲癇(epilepsy)起因于腦部不正常放電而引起的抽筋、抽搐性神經性癥狀(neurological disorders)，發病率約1%～2%。目前治療方式多以抗癲癇藥物(antiepilepticdrugs，AEDs)來舒緩癥狀的發作，大多數的病患能因此得到良好的癥狀控制，但約有30%的患者即使給予足夠量的藥物仍無法有效控制癲癇癥狀，而稱為耐藥性癲癇(drug resistant epilepsy)[1～3]。癲癇患者對抗癲癇藥物產生耐藥性(pharmacoresistance)的機制目前還不清楚，可能包含許多因素[4～6]：有可能是基因例如基因多型性造成的，可以解釋為何有相同癲癇癥狀的病患對同一種抗癲癇藥物卻有不同的反應；也可能是治療的過程中，疾病本身的因素改變了藥物的目標受體或藥物進入腦部的含量；另外也可能是藥物的因素例如對藥物的容忍性(tolerance)上升使得藥效降低而無法有效控制癲癇癥狀。多數的耐藥性癲癇病患都具有1個重要特征，即不只會對一種而是對大部分甚至是所有的抗癲癇藥物皆會產生耐藥性，所以若第一種抗癲癇藥物無法有效控制癲癇癥狀，即使服用不同機制的抗癲癇藥物，也僅有約10%的機會能得到良好控制，此現象說明耐藥型癲癇所產生的耐藥性應該不是通過藥物目標受體的改變，而可能是血腦屏障的轉送器大量表現，進而非專一性的降低所有進入腦部的抗癲癇藥物含量。國外研究表明GABAARG2基因變異可能會導致用戶出現驚厥疊加全面性癲癇[7，8]，目前國內尚未有GABAARG2基因多形性與耐藥性癲癇之間的關系的研究，本文針對昆明地區癲癇患者分析GABAARG2基因在癲癇耐藥機制中的作用，對臨床治療具有一定的參考價值。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

對來本院就診的癲癇患者進行腦部影像掃描和腦電圖測量，納入標準：(1)昆明漢族人；(2)至少有兩次以上的癲癇發病史，且兩次間隔時間不低于2 h；(3)已經正常服用藥物。排除標準：(1)無法確診癲癇類型；(2)后天大腦受損傷的有明確病因導致的癲癇；(3)肝腎功能不全者；(4)不簽署知情同意書或無法溝通者。最終選擇98例患者作為研究對象，并根據對抗癲癇藥物的反應性，分為耐藥組(觀察組)46例和敏感組(對照組)52例，觀察組患者平均年齡為(26.17±10.38)歲，對照組平均年齡為(25.78±11.37)歲，所有患者或家屬簽署知情同意書，本研究通過醫院倫理學會的審核。

1.2 材料與方法

1.2.1 提取DNA 受試者抽取 10 ml 靜脈血后和heparin 混合均勻，儲存于-20 ℃冰箱做genomic DNA 制備。分析受試者的GABAARG2基因型，統計出該基因C588T多態位點在患者中的出現頻率。以Gentra基因組DNA純化試劑盒(Gentra Genomic DNA purification kit) 抽取genomic DNA，再以限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應技術 (PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP) 鑒定GABAARG2基因型[9，10]。具體流程如下：

(1) DNA純化：使用Gentra基因組DNA純化試劑盒，300 ml全血加入900 μl 紅細胞消散溶液(RBC Lysis Solution)，顛倒混勻后，室溫15 min，13000 r/m 離心20 s。

(2) 除上清液，留下約 20～30 ml溶液，劇烈振蕩30 s，加300 ml 細胞裂解液(Cell Lysis Solution)，劇烈振蕩30 s，37 ℃過夜保存。

(3) 加1.5 ml核糖核酸酶A溶液(RNase A solusion)，顛倒混勻5～8次，放置15 min，加100 μl蛋白沉淀液(Protein Precipitation Solution)，劇烈振蕩30 s，13000 r/m離心3 min。

(4)取上清液，加 300 μl 100%異丙醇，輕輕混合至DNA 已完全析出，13000 r/m 離心1 min，除上清液加70%酒精顛倒漂洗1～3 min，13000 r/m 離心1 min。

(5)除上清液，倒置至乙醇完全揮發，加40 ml DNA Hydration Solution，室溫過夜回溶DNA以分光亮度計測量 OD260 定量。

1.2.2 試驗設計 每一位受試者，都會以口服傳統抗癲癇藥物-苯妥英(phenytoin)的方式來觀察藥物在體內的影響。實驗設計是希望同一位受試者口服phenytoin的血中濃度-時間曲線下面積值(area under concentration-time curve；AUC)與靜脈注射phenytoin的AUC值相同，每一位受試者皆口服phenytoin 300 mg。實驗方法：每一位受試者在第一階段先口服單一劑量phenytoin 300 mg，在特定的抽血時間點收集靜脈血后，以HPLC求出血中濃度-時間曲線圖，同時求出此位受試者的口服吸收率。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 各組研究對象一般資料及臨床資料比較

觀察組和對照組的患者資料比較見表1所示，兩組患者在年齡、性別、發作次數、持續狀態方面差異均無統計學意義(P>0.05)，而觀察組GABAARG2基因出現概率明顯高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。GABAARG2基因的二維圖以及對應的PCR電泳圖如圖1和圖2所示。

表1 兩組研究對象一般資料及臨床資料比較

2.2 各組患者對phenytoin的口服吸收率

由表2中可見，觀察組患者的phenytoin總體吸收率為68.71%±12.28，明顯小于對照組的吸收率82.36%±15.31%，差異具有統計學意義(P<0.05)。另外由表3可見，觀察組和對照組中出現GABAARG2基因的患者的phenytoin吸收率顯著低于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。

表2 兩組研究對象總體的口服吸收率(%)

表3 兩組研究對象的分類口服吸收率

圖1 GABAARG2基因的二維圖

圖2 GABAARG2基因PCR電泳圖

3 討 論

約有30%的癲癇病患對于各種抗癲癇藥物皆會產生耐藥性(pharmacoresistance)，與癌細胞對抗癌藥產生抗藥性相似，進而造成耐藥型癲癇。Tishler 在1995 年首先發現在對藥物具有抗性的癲癇病患腦部中有GABAARG2基因大量表現的情況，同時腦部的微血管內皮細胞及星狀細胞中GABAARG2基因的表現量上升，這可能限制AEDs 進入腦部的含量，因此GABAARG2基因被認為在耐藥型癲癇所產生的耐藥性中可能扮演了重要的角色[11]。沈江華等[12]在具耐藥性的癲癇病患腦部的神經膠質細胞及星狀細胞發現GABAARG2基因有大量表現的情況，使得癲癇發作區的AEDs濃度下降進而導致病患對AEDs 的治療產生耐藥性；而有研究顯示在血腦屏障(blood-brain-barriers，BBB)的微血管內皮細胞及癲癇病灶處過度表現的P糖蛋白可能是導致耐藥性產生的重要原因，進而造成耐藥型癲癇[13]。

GABAARG2基因具有功能性的單核苷酸多型性(SNPs，single nucleotide polymorphism)，這些SNPs可能改變GABAARG2的功能而影響其對AEDs的運輸，故GABAARG2上的基因多型性在癲癇病患所產生的耐藥性中可能扮演了重要的角色；而GABAARG2具有功能性的SNPs 使其表現量上升與耐藥性產生的相關性則不僅局限在腦部，在小腸表現的GABAARG2基因可能扮演了藥物由腸腔進入血液循環的屏障，進而影響抗癲癇藥物的口服吸收率[14，15]。在耐藥型癲癇病患中發現GABAARG2基因表現量上升，即使持續給予抗癲癇藥物phenytoin 或phenobarbital，患者血液中的藥物濃度仍無法維持正常的治療劑量。因為GABAARG2基因在血腦屏障微血管內皮細胞中大量表現可能會影響藥物在血腦屏障的通透性，故AEDs 如果是P糖蛋白的受質，在臨床上將具有重要的意義[16]。

抗癲癇藥物 phenytoin是一重要且普遍使用的抗癲癇藥物，不過卻一直存在個體間的用藥差異性。Phenytoin 口服的生體可用率差異很大，是由首渡效應的差異所造成。不同癲癇病患對同一種抗癲癇藥物反應結果可能不一樣，目前推測可能與藥物基因體學有關[17，18]。耐藥型癲癇病患對各種不同機制的抗癲癇藥物都會產生耐藥性，與癌細胞對抗癌藥物產生的多重抗藥性相似，而同時在耐藥型癲癇病患腦部也可以發現GABAARG2基因的表現量大量上升，此可能是疾病的重要成因，所以GABAARG2基因在耐藥型癲癇的藥物基因體學上被認為可能扮演了重要的角色[19，20]。

本文對癲癇患者口服phenytoin，觀察在兩組患者GABAARG2基因表現對phenytoin藥物吸收的影響。研究結果發現，觀察組的總體吸收率為(68.71±12.28)%，而對照組的吸收率為(82.36±15.31)%，兩組患者的口服吸收率具有顯著差異(P<0.05)，另外觀察組和對照組中出現GABAARG2基因的患者的口服吸收率明顯低于對照組(P<0.05)，與先前的研究結果類似，故證實GABAARG2基因對癲癇患者口服phenytoin的吸收率有確切的影響，在耐藥型癲癇病形成上扮演了重要的角色。然而是否真的具有功能性的基因多型性位點而影響GABAARG2基因的表現量與功能，進而影響臨床用藥的藥效或藥動性質仍需做進一步的研究。

[1]張 鑫，譚啟富，王衛萍. 藥物難治性癲癇患者腦內多種耐藥基因表達的初步研究[J]. 中華神經外科雜志，2013，42(6)：11-17.

[2]吳家驊. 難治性癲癇的診斷與治療[J]. 中華兒科雜志，2014，61(05)：12-18.

[3]肖 波，王 蓉，謝光潔. 難治性癲癇動物模型研究進展[J]. 中華神經科雜志，2013，38(2)：23-29.

[4]Lee G，Bendayan R. Functional expression and localization of p-glycoprotein in the central nervous system：relevance to the pathogenesis and treatment of neurological disorders[J]. Pharmaceutic Res，2014，47(8)：26-29.

[5]Rosado C，Sheree E，Cross W. Effect of Vehicle Pretreatment on the Flux，Retention，and Diffusion of Topically Applied Penetrants in Vitro[J]. Pharmaceutic Res，2013.45(9)：36-42.

[6]焦 正，鐘明康，施孝金. HPLC法同時測定人血清中卡馬西平、環氧化卡馬西平和苯妥英[J]. 藥物分析雜志，2012，49(6)：49-53.

[7]張金蘭，劉 穎，周同惠. 微透析取樣技術在藥物代謝研究中的應用及前景[J]. 藥學學報，2015，61(7)：73-81.

[8]呂 洋，晏 勇，王學峰. 抗癲癇藥體外誘導鼠星形膠質細胞多藥耐受基因P-糖蛋白的表達[J]. 中華神經科雜志，2013，49(1)：92-95.

[9]潘松青，胡振序，徐家萱，等. 15例難治性癲癇苯妥因鈉藥代動力學研究[J]. 中華內科雜志，2014，53(5)：77-79.

[10]Sabine SK，Johanna B，Leonilla E. Expression and functional activity of the ABC-transporter proteins p-glycoprotein and multidrug-resistance protein 1 in human brain tumor cells and astrocytes[J]. J Neuro Oncol，2012，107(1)：35-39.

[11]Zhang L，Ong WY，Lee T. Induction of P-glycoprotein expression in astrocytes following intracerebroventricular kainate injections[J]. Exp Brain Res，2015，72(4)：109-116.

[12]沈江華，姜德春，王育琴. 難治性癲癇患者腦組織致癇灶與灶旁組織藥物濃度的比較研究[J]. 中國藥學雜志，2011，63(10)：78-85.

[13]李 建，姜德春，張國君. 難治性癲癇患者腦組織內致癇灶與其周圍組織P糖蛋白表達量的比較[J]. 中國藥物依賴性雜志，2015，49(3)：29-32.

[14]呂 洋，晏 勇，王學峰，等. 抗癲癇藥體外誘導鼠星形膠質細胞多藥耐受基因P-糖蛋白的表達[J]. 中華神經科雜志，2013，61(1)：65-67.

[15]Chaichon L，Vorasuk S. Pharmacogenetic screening of carbamazepine-induced severe cutaneous allergic reactions[J]. JClinic Neurosci，2014，75(10)：38-46.

[16]Eva C，Maria D，Pierre-Alain C. The permeability P-glycoprotein：a focus on enantioselectivity and brain distribution[J]. Exp Opin Drug Metabolis Toxicol，2016，136(8)：113-117.

[17]Ritu K，Ram L，Kalita J. Association of alpha subunit of GABA A receptor subtype gene polymorphisms with epilepsy susceptibility and drug resistance in north Indian population[J]. Seizure：Euro J Epilepsy，2013，72(4)：29-35.

[18]Hecimovic H，Stefulj J，Cicin-Sain L，et al. Association of serotonin transporter promoter (5-HTTLPR) and intron 2 (VNTR-2) polymorphisms with treatment response in temporal lobe epilepsy[J]. Epilepsy Res，2015，56(1)：19-26.

[19]Sandeep G，Kiran B，Sangeeta SM. Absence of a general association between ABCB1 genetic variants and response to antiepileptic drugs in epilepsy patients[J]. Biochimie，2012，83(9)：12-17.

[20]Jiang DC，Bai XR，Zhang QX. Effects of CYP2C19 and CYP2C9 genotypes on pharmacokinetic variability of valproic acid in Chinese epileptic patients：nonlinear mixed-effect modeling[J]. Euro J Clinic Pharmacol，2013，82(12)：57-59.

Association study between the C588T polymorphism of GABAARG2 gene and drug-resistant epilepsy

QILing，LIPeiyun，XINGDongmei，etal.

(DepartmentofNeurology，thethirdpeople’sHospitalofYunnanProvince，Kunming650011，China)

Objective To investigate the relationship between GABAARG2 gene and drug-resistant epilepsy in patients with epilepsy. Methods According to the reactivity of the anti epileptic drugs，98 patients with epilepsy were divided into two groups：drug-resistant group (observation group) and sensitive group (control group)，there were 46 patients in the observation group and 52 patients in the control group. DNA of all patients was extracted and the probability of occurrence of GABAARG2 gene was determined by PCR gene sequencing. For each subject，oral antiepileptic drug phenytoin (Phenytoin) was taken to compare the oral absorption rate of drugs of two groups of patients. Results There was no significant difference in age，sex，past history and status of persistent disease between observation group and control group (P>0.05). But the probability of GABAARG2 gene in the observation group was significantly higher than that in the control group，the difference was statistically significant(χ2=8.08，P=0.01). The total oral absorption rate of the observation group(68.71%±12.28%) was significantly lower than that of the control group(82.36%±15.31%)，the difference was statistically significant (χ2=6.78，P=0.01). Conclusion GABAARG2 gene expression in the brain will affect the effect of antiepileptic drugs，it has good reference value for drug resistance in patients.

GABAARG2 gene； Phenytoin； Drug-resistant epilepsy； Pleomorphism

1003-2754(2017)01-0027-04

2016-09-08；

2016-12-21

(云南省第三人民醫院神經內科，云南 昆明 650011)

賈 帆，E-mail：sheyinggv@163.com

R742.1

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