高滲氯化鈉羥乙基淀粉40對大鼠腦缺血再灌注損傷后MMP-9和層粘連蛋白表達的影響

劉星芳， 張秀梅， 賴麗娟， 舒 鵬， 黃志華， 占麗芳， 單熱愛4，， 黃 誠

高滲氯化鈉羥乙基淀粉40對大鼠腦缺血再灌注損傷后MMP-9和層粘連蛋白表達的影響

劉星芳1， 張秀梅1， 賴麗娟1， 舒 鵬2， 黃志華3，4， 占麗芳5， 單熱愛4，5， 黃 誠3，4

目的 探討高滲氯化鈉羥乙基淀粉40(HSH)對大鼠腦缺血-再灌注(I/R)損傷后神經(jīng)功能行為學(xué)評分，腦水腫情況，腦梗死體積以及腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)和層粘連蛋白(Laminin)表達的影響。方法 48只雄性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、實驗1組、實驗2組。大鼠局灶性腦I /R損傷模型制備成功后120 min，假手術(shù)組和模型組靜脈輸注0.9%生理鹽水，實驗1組和2組分別靜脈輸注HSH 4 ml/kg和8 ml/kg。再灌注24 h后，行神經(jīng)功能行為學(xué)評分，觀察腦水腫情況，TTC染色測算腦梗死體積，用免疫印跡方法檢測缺血區(qū)腦組織MMP-9和Laminin的表達。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能行為學(xué)評分升高(P<0.001)；腦水腫加重；腦梗死體積增加(P<0.001)；MMP-9蛋白表達升高(P<0.05)；Laminin蛋白表達降低(P<0.01)。與模型組比較，實驗1組和2組神經(jīng)功能行為學(xué)評分降低(P<0.001)；腦水腫緩解；腦梗死體積減少(P<0.001)；實驗1組MMP-9蛋白表達減少(P<0.01)，Laminin蛋白表達升高(P<0.05)；實驗2組MMP-9蛋白和Laminin蛋白表達均無明顯變化。結(jié)論 用HSH治療大鼠腦I /R損傷后，大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分改善，腦水腫減輕，腦梗死體積減小，血腦屏障通透性降低，其機制可能與降低MMP-9和增加Laminin蛋白的表達有關(guān)。且保護作用以4 ml/kg劑量效果更佳。

腦缺血再灌注損傷； 高滲氯化鈉羥乙基淀粉40； MMP-9； Laminin

高滲氯化鈉羥乙基淀粉(HSH)是一種血容量擴充藥，它具有減輕組織水腫、改善微循環(huán)、提高晶體與膠體滲透壓的優(yōu)點[1]。課題組前期研究表明，HSH對腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷有保護作用[2～4]，且降低腦組織含水率。因此，HSH很可能通過保護血腦屏障起作用。本實驗通過TTC染色觀察腦梗死體積及檢測血腦屏障相關(guān)蛋白MMP-9和Laminin，進一步探討HSH對大鼠急性腦I/R損傷后血腦屏障的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SD大鼠24只(購自贛南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心)，體重250～300 g，隨機均分成假手術(shù)組、模型組、實驗1組(4 ml/kgHSH)和實驗2組(8 ml/kgHSH)。

1.2 腦缺血再灌注損傷模型制備 大鼠用10%的水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉后，模型組、實驗1組和實驗2組采用大腦中動脈拴線法[5，6]制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，將一尼龍線(長4 cm，直徑0.26 mm)經(jīng)頸總動脈主干切口緩慢向頸內(nèi)動脈入顱方向推進，以頸總動脈分叉處為標記，推進18～20 mm感到輕微阻力時，達到大腦前動脈，阻斷大腦中動脈的所有血液供應(yīng)，120 min后，拔出尼龍線，縫合皮下組織和皮膚，完成腦缺血再灌注損傷模型。假手術(shù)組僅需要暴露和分離出頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，不閉塞大腦中動脈。術(shù)中嚴格控制室溫在23～25 ℃。實驗動物在腦缺血120 min后，假手術(shù)組和模型組經(jīng)舌下靜脈輸注0.9%生理鹽水4 ml/kg，實驗1組和2組分別從舌下靜脈輸注HSH 4 ml/kg和8 ml/kg，均于30 min內(nèi)微量泵恒速輸完。大鼠蘇醒后，放回鼠籠。

1.3 神經(jīng)功能行為學(xué)評分 再灌注24 h后，參照Longa氏評分標準[5]進行神經(jīng)功能行為學(xué)評分。0分：未觀察到神經(jīng)功能缺陷癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺陷，不能完全伸展手術(shù)對側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺陷，向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度神經(jīng)功能缺陷，向手術(shù)對側(cè)傾倒；4分：不能行走，意識昏迷。

1.4 TTC染色觀察腦梗死體積 大鼠斷頭取腦后，-20 ℃冰凍3 min后，以矢狀縫后人字形分叉點為起始標記點切成1.0～2.0 mm厚(6片/只)腦片置于2%氯化2、3、5-三苯基四氮唑溶液中，37 ℃避光溫育30 min，然后移至PBS配制的4%多聚甲醛液中固定，腦梗死區(qū)呈白色，照相。

2 結(jié) 果

2.1 HSH對腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能行為學(xué)評分、腦水腫和腦梗死體積的影響 與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能行為學(xué)評分增高(P<0.001)，腦水腫情況明顯，腦梗死體積增加(P<0.001)。與模型組比較，實驗1組和2組神經(jīng)功能行為學(xué)評分降低(P<0.001)，腦水腫情況緩解，腦梗死體積減小(P<0.001)(見表1和圖1、2)。

2.2 HSH對腦缺血再灌注損傷后MMP-9和Laminin蛋白的表達的影響 與假手術(shù)組比較，模型組損傷側(cè)腦組織中MMP-9蛋白的表達明顯增多(P<0.05)，Laminin蛋白表達明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，實驗1組損傷側(cè)腦組織中MMP-9蛋白的表達減少(P<0.01)，Laminin蛋白表達升高(P<0.05)，實驗2組MMP-9蛋白和Laminin蛋白表達均無明顯變化(見圖3，圖4)。

組別神經(jīng)功能評分(分)腦梗死體積(%)假手術(shù)組模型組實驗1組實驗2組02.5±0.5*0.9±0.8△1.6±0.5△029.9±0.6*2.9±0.4△5.7±0.4△

與假手術(shù)組比較*P<0.001；與模型組比較△P<0.001

圖1 各組腦水腫情況

圖2 各組TTC染色腦梗死范圍的影響

與假手術(shù)組相比*P<0.05；與模型組相比##P<0.01

與假手術(shù)組相比**P<0.01；與模型組相比#P<0.05

3 討 論

高滲氯化鈉羥乙基淀粉40(HSH)為復(fù)方制劑，含10.5 g 4.2%氯化鈉+19 g 7.6%羥乙基淀粉40，數(shù)字模型下晶膠最合適比例。前期研究表明，在大鼠腦缺血再灌注損傷模型中HSH可降低缺血區(qū)腦組織iNOS活性、減少NO含量[2]；提高大鼠腦I/R的抗氧化作用、增強氧自由基的清除[3]；使腦組織Ca+-Mg+-ATPase活性的升高可促進Ca+向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運，降低細胞內(nèi)的Ca+濃度，從而對抗腦缺血-再灌注損傷所致的鈣超載，保護腦細胞[4]。本實驗結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，HSH可以改善大鼠腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)功能行為學(xué)評分、腦水腫情況以及腦梗死體積。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是調(diào)控腦內(nèi)基質(zhì)最重要的酶系統(tǒng)之一，MMPs介導(dǎo)緊密結(jié)合蛋白的降解是早期BBB損傷的一個重要機制[7]。其中MMP-9與腦缺血水腫時血腦屏障的破壞關(guān)系最為密切，它能降解和重塑細胞外基質(zhì)，促進血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的聚集和遷移，調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡，參與血管反應(yīng)的病理生理過程以及神經(jīng)血管的再生和重塑[8]。腦缺血時，MMP-9被誘導(dǎo)激活，通過降解緊密連接蛋白和基底膜成分[9]導(dǎo)致血管壁完整性破壞，從而增加BBB通透性，導(dǎo)致血管源性水腫、白細胞浸潤和出血性轉(zhuǎn)化，加重神經(jīng)功能缺損[10]。本實驗發(fā)現(xiàn)，模型組中MMP-9蛋白的表達明顯升高，這可能是因為缺血再灌注損傷誘發(fā)炎癥反應(yīng)或者氧自由基，刺激MMP-9的基因轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致MMP-9合成增加。而HSH實驗組的大鼠MMP-9蛋白的表達明顯低于模型組。HSH可能通過同時提高晶體和膠體的滲透壓，減輕腦水腫，改善腦血供，從而減少MMP-9的表達。

Laminin主要存在于基底膜結(jié)構(gòu)中，是基底膜所特有的非膠原糖蛋白。Laminin的主要功能是作為基底膜的主要結(jié)構(gòu)成分對基底膜的組裝起關(guān)鍵作用，在細胞表面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)并將細胞固定在基底膜上。在缺氧或炎癥導(dǎo)致的BBB功能障礙中，Laminin作為一個關(guān)鍵分子參與了BBB損傷后的修復(fù)[11]。由于Laminin是MMP-9的主要作用底物，所以在腦缺血損害中Laminin的降解可破壞BBB的完整性，加重BBB的損害[12]。本實驗顯示，腦缺血再灌注損傷后Laminin蛋白的表達明顯降低，這和MMP-9的表達成負性相關(guān)。這更說明了，可能是腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的水腫和炎癥等因素造成MMP-9合成增多從而使Laminin的降解也增多。而HSH實驗組中的Laminin的表達明顯升高，故認為HSH保護血腦屏障，減輕腦水腫也與Laminin表達增加有關(guān)，除可能因MMP-9表達降低，Laminin破壞減少，HSH是否可以直接刺激Laminin表達增加尚未見報道。

HSH實驗組中，4 ml/kg組比8 ml/kg組效果更好，可能原因是8 ml/kg的劑量對于腦缺血再灌注大鼠來說容量負荷過大，減弱了對腦組織細胞的保護作用。也可能因為BBB嚴重破壞導(dǎo)致HSH在兩側(cè)的梯度滲透壓減弱，只有在HSH的有效窗才能取得平衡，且與BBB的損傷程度成反比[13]。

本研究結(jié)果表明，腦缺血再灌注損傷后，MMP-9蛋白表達的升高和Laminin蛋白表達的減少參與了其病理變化，促進BBB的損傷，使得大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)評分和腦梗死體積等均增加，腦水腫明顯。早期給予HSH治療可能通過減少MMP-9蛋白的表達，增加Laminin蛋白的表達對缺血再灌注腦損傷具有一定程度的保護作用。

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Effect of hypertonic sodium chloride hydroxyethyl starch 40 on expression of MMP-9 and Laminin after rats cerebral ischemia reperfusion injury

LIUXingfang，ZHANGXiumei，LAILijuan，etal.

(MasterGraduateStudent，GannanMedicalUniversity，Ganzhou341000，China)

Objective To observe the effect of Hypertonic Sodium Chloride Hydroxyethyl Starch 40 (HSH) on neurological evaluations，degree of encephaledema，cerebral infarction volume and expression of MMP-9 and Laminin in rat cerebral ischemia/reperfusion(I/R) injury model. Methods 48 male SD rats were randomly divided into shame，model，experimental 1 and 2 group. Rat focal cerebral I/R injury model should been accomplished，after 120 minutes，shame and model group were treated with physiological saline，experimental 1 and 2 group were treated with 4 ml/kg and 8 ml/kg HSH by vein injection. After 24 hours’ reperfusion，neurological evaluations，TTC staining and degree of encephaledema would be executed，the expression of MMP-9 and Laminin would be tested by western blotting. Results Compared to the shame group，model group’s cerebral neurological evaluations(P<0.001)，infarction volume(P<0.001) and expression of MMP-9(P<0.05) respectively increased with an obvious encephaledema，but Laminin decreased(P<0.05). Compared to model group，experimental 1 and 2 group’s neurological evaluations(P<0.001) and cerebral infarction volume(P<0.001) decreased with a catabatic degree of encephaledema；the expression of MMP-9 in experimental 1 group decreased(P<0.05) and Laminin increased(P<0.05)，but those of experimental 2 group had no obvious change. Conclusion HSH can significantly reduce neurological evaluations，cerebral infarction volume，degree of encephaledema and BBB’s permeability in rat cerebral I/R injury model. These findings indicated that MMP-9 and Laminin may be involved in the protective mechanisms of HSH against cerebral I/R injury. The dose of 4 ml/kg is better.

Cerebral ischemia reperfusion injury； Hypertonic sodium chloride hydroxyethyl starch 40； MMP-9； Laminin

1003-2754(2017)01-0009-04

2016-09-12；

2016-12-03

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(No. GJJ12548)；江西省自然科學(xué)基金項目(No. 20142BAB205020)；贛南醫(yī)學(xué)院研究生創(chuàng)新專項資金項目(No. YC2015-S408) 作者單位：(1.贛南醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，江西 贛州 341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院本科生，江西 贛州 341000；3.贛南醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，江西 贛州 341000；4.贛南醫(yī)學(xué)院疼痛醫(yī)學(xué)研究所，江西 贛州 341000；5.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科，江西 贛州 341000)

單熱愛，E-mail：shanreai@163.com

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