一種可同步檢測3種外源基因的多重PCR方法

尹 全，李 憶，鄧 強，敬 媛

（1.四川省農業科學院分析測試中心，四川成都610066；2.四川民族學院環境與生命科學系，四川康定626001；3.甘孜州農產品質量安全中心，四川康定626000）

一種可同步檢測3種外源基因的多重PCR方法

尹 全1，李 憶2，鄧 強1，敬 媛3

（1.四川省農業科學院分析測試中心，四川成都610066；2.四川民族學院環境與生命科學系，四川康定626001；3.甘孜州農產品質量安全中心，四川康定626000）

為建立一種可同步檢測3種外源基因的多重PCR方法，試驗選擇較常見的T-CaMV 35S，P-CaMV 35S和pat這3個基因作為多重PCR檢測對象，對多重PCR體系中引物濃度配比和引物退火溫度進行優化。結果表明，多重PCR適宜的引物終濃度（μmol/L）配比T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat為0.2∶0.2∶0.2以及適宜的引物退火溫度為56℃；采用優化后的反應體系對多重PCR體系靈敏度進行測試，結果顯示，方法靈敏度為0.5 ng；通過利用建立的多重PCR方法對已知樣品進行檢測，結果表明，試驗建立的多重PCR體系具有良好的可靠性。

T-CaMV 35S；P-CaMV 35S；pat；多重PCR；檢測

近年來，隨著生物技術的不斷發展，多種轉基因農作物（genetic modified crops，GMC）應用于農業生產，在一定程度上提高了農作物的產量及農產品的質量，有效地緩解了世界人口過多、可耕作土地面積不斷減少以及不可預測自然災害帶來的不利影響等。

2015年是轉基因作物商業化的第20年，轉基因作物種類在持續增加，其種植面積也連續增加了19 a，在2015年有所下降。截至2015年，全球28個國家種植了1.8億hm2的轉基因作物，比2014年28個國家的1.81億hm2有所減少[1]。種植的轉基因農作物主要包括大豆、玉米、棉花和油菜。轉基因作物的發展給全球帶來了很多收益，據Klumper和 Qaim在2014年全球各地進行的調查試驗得到的原始數據，結合過去20 a的147項已知轉基因作物研究綜合分析表明，轉基因作物的出現使化學農藥的使用減少了37%、作物產量增加了22%、農民收入增加了68%[2]。但隨著轉基因技術的不斷發展，轉基因農產品及加工產品不斷增多，人們廣泛關注其安全性問題，相關轉基因產品標識制度也被越來越多國家制定并實施[3]。而轉基因相關檢測技術的發展是保證轉基因標識制度有效實施的前提條件。

目前，蛋白檢測和核酸檢測是轉基因檢測技術的兩大類。其中，核酸檢測技術中，主要用于農作物及其產品的轉基因檢測[4-5]的常規PCR技術因其具有快速、敏感、簡便的特點而被廣泛采用。然而，利用核酸檢測技術進行檢測時，確認樣品中是否含有轉基因外源基因成分往往需要對多個外源基因進行篩選檢測。盡管常規PCR在轉基因檢測技術中優勢明顯，但若是對多個外源基因分別檢測時，也存在耗時、繁瑣和耗費大等問題[6]。因此，為解決常規PCR技術在檢測多個基因時存在的問題，多重PCR應運而生，該技術是將多對特異性引物加入一個PCR反應體系中，針對多個DNA模板擴增多個目的片段[7-8]。由于多重PCR具有操作簡便、節省時間、提高效率、降低成本的特點[9-10]，被廣泛應用于轉基因、病原菌和動物源性等方面的檢測[11-13]。

多重PCR技術應用于作物外源基因檢測中較為普遍，但在前人研究中并沒有選擇T-CaMV 35S，P-CaMV 35S和pat這3種外源基因作為檢測組合的多重PCR體系。本研究擬通過對多重PCR檢測方法優化，旨在建立包括T-CaMV 35S，P-CaMV 35S和pat這3種外源基因的多重PCR篩選檢測體系。

1 材料和方法

1.1 供試材料及試劑

試驗材料均由四川省農業科學院分析測試中心保存；離心機（5424，德國eppendorf公司），PCR儀（Veritee96-well，美國ABI公司），DNA超微量分光光度計（NanoDrop 1000，美國Thermo公司），毛細管電泳儀（QIAxcel Advanced，德國Qiagen公司）；植物基因組提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；Master Mix購于日本東洋紡績株式會社；引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設計 選擇常見的T-CaMV 35S，PCaMV 35S和pat這3個基因作為檢測對象，特異性引物序列參照相關國家標準（表1）。

表1 試驗所用引物

1.2.2 樣品DNA提取 樣品DNA提取采取試劑盒方法進行[16]。

1.2.3 多重PCR方法的優化建立

1.2.3.1 單基因特異性 在反應總體積為25 μL的PCR體系中進行單基因的擴增。反應體系為：Master Mix（2×）12.5 μL，正反向引物各1 μL，模板2 μL。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共運行35個循環；最后72℃延伸3 min。當PCR反應結束后，立即對擴增產物進行結果分析，確定單基因引物是否具有特異性。

1.2.3.2 多重PCR反應條件的優化 在25 μL反應體系中對退火溫度進行優化。Master Mix（2×）12.5μL，3對引物中正反向引物各0.25μL，模板2μL。優化反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，退火溫度設置64，60，58，56，54，50℃6個梯度，退火30 s，72℃延伸30 s，運行35個循環；最后72℃延伸3 min。當PCR反應結束后，立即對擴增產物進行結果分析，確定多重PCR反應程序中最適宜的退火溫度。

在25 μL反應體系中對引物濃度進行優化。Master Mix（2×）12.5 μL，引物終濃度配比按照表2設置相應的濃度梯度，DNA模板2 μL。PCR反應程序按照優化后確定的程序進行。當PCR反應結束后，立即對擴增產物進行結果分析，確定多重PCR反應體系中最適宜的引物終濃度配比。

表2 PCR引物終濃度配比

1.2.4 多重PCR檢測靈敏度分析 基因組DNA用ddH2O進行梯度稀釋，使得反應體系中基因組DNA總質量分別為50，10，3，1，0.5，0.1 ng，使用1.2.3中的反應體系及優化后的反應條件分析多重

為了解當前高校英語數字化教學資源共建共享情況，筆者進行了網絡調查和走訪部分學校，發現當前高校英語數字化教學資源共建共享不容樂觀，主要存在以下亟待解決的問題。

PCR方法的靈敏度。

1.2.5 多重PCR檢測已知樣品 用優化獲得的多重PCR檢測體系對已知樣品進行檢測驗證。

2 結果與分析

2.1 樣品總DNA提取結果

樣品總DNA通過超微量紫外分光光度計測定濃度和質量，經測定得知，所有樣品的OD260/OD230值均大于2.0，OD260/OD280值在1.8～2.0，DNA的濃度和質量能滿足本試驗PCR要求，再將各樣品總DNA濃度稀釋至25 ng/μL。

2.2 單基因特異性驗證結果

從圖1可以看出，3對引物均能在相應目標位置處觀察到特異性條帶，而非特異性條帶未見明顯擴增。由此可知，本試驗選擇的引物可用于多重PCR檢測體系研究。

2.3 多重PCR體系優化結果

由圖2可知，在64℃條件下，T-CaMV 35S基因的目的條帶未得到有效擴增，所以，退火溫度為64℃不適合；在60℃條件下，T-CaMV 35S基因的目的條帶擴增量太小，在150，280，540 bp左右處出現了3條非特異性條帶，顯然退火溫度60℃也不適合；在50，58℃條件下，所有目的條帶都能得到擴增，但是目的條帶間的擴增量不一致，所以，這2個溫度條件也不適合；而在退火溫度為54℃時，各目的條帶的擴增量相對一致，但在370，540 bp左右處出現了1條非特異性條帶，退火溫度54℃也不適合；在56℃時，雖然在540 bp左右處也出現了1條非特異性條帶，但并不影響對結果的判斷。因此，最終選擇多重PCR體系的適宜退火溫度為56℃。

引物濃度梯度試驗結果如圖3所示。從圖3可以看出，引物終濃度配比按照方案A，C，D，E，F配比時，目的基因存在擴增效率不一致、無擴增或擴增量小等情況，結果均不太理想；引物終濃度僅按照方案B配比時，各目的基因間的擴增效率相對較高并且相對一致。所以適宜的引物終濃度（μmol/L）配比最終確定為T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat為0.2∶0.2∶0.2。

2.4 多重PCR反應體系靈敏度分析

由圖4可知，只有在模板濃度不低于0.5 ng時，3個目標片段才可得到有效擴增。當模板終濃度低至0.5 ng時，所有目的片段均可得到有效擴增，但擴增量相對偏小；在模板濃度低于0.5 ng時，3個外源基因幾乎沒有擴增。表明建立的多重PCR檢測體系靈敏度不低于0.5 ng。

2.5 多重PCR檢測已知樣品結果

選擇已知樣品對優化后的多重PCR反應體系進行驗證，結果如圖5所示。從圖5可以看出，所有樣品分子特征顯示的外源基因與擴增目的條帶是對應的。此結果再次驗證了多重PCR檢測體系的可靠性。

3 討論

隨著科學技術的不斷發展，獲得的轉基因生物越來越多，同時轉入的外源基因類型也日益增多，導致轉基因產品外源基因成分日漸趨于復雜化。因此，尋求一種快速、簡便、經濟、準確的檢測方法將對轉基因相關產品的檢測產生有益效果。多重PCR方法被CHAMBERLAIN等[18]于1988年首次提出，截至目前已被廣泛應用于檢測中的各個領域，包括基因多態性分析、定性定量分析、微生物耐藥檢測及動物源性檢測等[19-20]，多重PCR是科研、檢測工作的主要手段，具有很高的實用價值。多重PCR技術只需一個反應和一次電泳即可同時檢出多個目的基因片段，可大大節約試劑和時間[21]。李會等[22]對多重PCR法快速檢測轉基因玉米多種轉化體技術優勢進行了比較分析研究，結果表明，與單一PCR檢測技術相比，成本降低了75%，檢測耗時縮短了63%，檢測產生的廢液減少了75%。

由于影響多重PCR反應的因素很多，要建立起準確、高效、可靠的多重PCR體系，就需要摸索出多重PCR檢測體系中各因素的最適宜條件。在多重PCR體系中，由于涉及較多引物，因此較易造成引物錯配、產生引物二聚體、出現非特異性帶等現象，從而降低多重PCR反應體系的擴增效率及特異性。基于此，本試驗采用不同引物濃度梯度對引物終濃度配比進行摸索，在結果中選擇各基因引物擴增效率大體一致、引物二聚體少、無非特異條帶的引物終濃度配比，最后確定較適宜的引物終濃度配比T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat為0.2∶0.2∶0.2。

PCR反應中，退火溫度對PCR的擴增影響較大，多重PCR體系也是如此，所以在多重PCR反應體系中另一個需要摸索的重要條件就是退火溫度。HENEGARIU等[23]研究表明，盡管單個目的片段的引物能夠在56～60℃特異性地擴增，但在多對引物共同反應的多重PCR體系中，適當降低退火溫度能夠更好地擴增所有目的片段。本試驗對3對特異引物間的退火溫度進行分析，選取64，60，58，56，54，50℃共6個溫度梯度，最終根據目的基因特異性條帶亮度一致性、無非特異性條帶和引物二聚體少等較優條件選擇了56℃作為多重PCR體系的退火溫度。

本試驗建立的多重PCR反應體系實現了一個反應中同時檢測多個轉基因成分，此方法在很大程度上提高了相關產品的檢測效率，同時也避免了單一PCR反應容易出現的漏檢現象，從而為轉基因相關初加工產品的檢測提供了一種更為準確、有效的方法。

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A Multiplex PCR Method for Simultaneous Detection of Three Exogenous Genes

YINQuan1，LI Yi2，DENGQiang1，JINGYuan3
（1.Analysis and TestingCenter，Sichuan AcademyofAgricultural Sciences，Chengdu 610066，China；2.Department ofEnvironmental and Life Sciences，Sichuan Universityfor Nationalities，Kangding626001，China；3.Agricultural Product QualitySafetyCenter ofGanzi Cityin Sichuan，Kangding626000，China）

Toestablish a multiplexPCR method for detectingthree kinds ofexogenous genes,the T-CaMV 35S,P-CaMV 35S and pat were selected as parameters ofmultiple PCR detection.The reaction conditions were optimized.The experimental results showed that the optimum annealing temperature of multiple PCR was 56℃,the optimum final concentration of primers（μmol/L）ratio was 0.2∶0.2∶0.2 for T-CaMV 35S∶P-CaMV 35S∶pat.Using the optimized reaction system to test the sensitivity of multiplex PCR system,the results showed that the sensitivity of the method was 0.5 ng.Using the method of multiple PCR to detect the known samples,the test results showed that the multiplexPCR systemwas established with good reliability.

Terminator CaMV 35S;Promoter CaMV 35S;pat;multiplexPCR;detection

Q503

：A

：1002-2481（2017）01-0037-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.01.10

2016-09-11

四川省財政現代農業技術創新與示范專項資金項目（2014CXSF-040）；四川省教育廳自然科學一般項目（15ZB0331）

尹 全（1981-），男，四川金堂人，助理研究員，碩士，主要從事轉基因植物安全評價工作。李 憶為通信作者。