CyclinD1和Bax在甲狀腺微小乳頭狀癌中的表達及意義*

魏廣民，周文波△，武 倫，魏 英，張 睿

(湖北醫藥學院附屬東風醫院：1.肝膽胰甲狀腺外科；2.實驗中心；3.病理科，湖北十堰 442000)

論著·臨床研究

CyclinD1和Bax在甲狀腺微小乳頭狀癌中的表達及意義*

魏廣民1，周文波1△，武 倫1，魏 英2，張 睿3

(湖北醫藥學院附屬東風醫院：1.肝膽胰甲狀腺外科；2.實驗中心；3.病理科，湖北十堰 442000)

目的 探究細胞周期蛋白D1(CyclinD1)和B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白(Bax)蛋白在甲狀腺微小乳頭狀癌中的表達及其價值。方法 選取2014年1月至2015年6月該院病理科存檔的甲狀腺疾病手術病例石蠟標本，應用免疫組織化學(MaxvisionTM/HRP免疫組織化學染色法)，以單克隆抗體兔抗人CyclinD1和鼠抗人Bax標記檢測72例甲狀腺微小乳頭狀癌、65例腺瘤組織和60例癌旁甲狀腺正常組織，觀察不同甲狀腺組織中CyclinD1和Bax蛋白表達情況。結果 CyclinD1蛋白表達在甲狀腺微小乳頭狀癌中的陽性率為79.17%，與腺瘤組織(χ2=14.730，P<0.01)、癌旁甲狀腺正常組織(χ2=80.404，P<0.01)的表達差異有統計學意義，其與患者年齡、性別及淋巴結轉移無明顯關聯(P>0.05)。Bax蛋白表達在甲狀腺微小乳頭狀癌中的陽性率為66.67%，與腺瘤中的表達差異無統計學意義(P>0.05)，與癌旁甲狀腺正常組織的表達差異有統計學意義(P<0.01)，其與淋巴結轉移有關聯(χ2=4.598，P<0.05)，與患者年齡、性別無明顯關聯(P>0.05)。甲狀腺微小乳頭狀癌中CyclinD1與Bax蛋白表達呈正相關關聯(χ2=11.463，r=0.435，P<0.01)。結論 CyclinD1和Bax蛋白在甲狀腺微小乳頭狀癌中高表達，與甲狀腺微小乳頭狀癌的發生、發展相關，兩者聯合檢測有助于對甲狀腺微小乳頭狀癌的診斷。

甲狀腺微小乳頭狀癌；cyclinD1；Bax；免疫組織化學

甲狀腺腫瘤是內分泌系統腫瘤中較為多見的腫瘤之一，而甲狀腺乳頭狀癌是最多見的甲狀腺惡性腫瘤[1]，其發病率呈逐步升高的趨勢[2]。直徑小于或等于1 cm的甲狀腺乳頭狀癌為甲狀腺微小乳頭狀癌(papillary thyroidmicrocarcinoma，PTMC)[3]。目前PTMC發病率約占甲狀腺乳頭狀癌的50%[4]。臨床上PTMC高腫瘤分期、甲狀腺外轉移、淋巴管侵襲及轉移的病例較多。PTMC的發生、發展受多種癌基因、凋亡基因的調控。文獻報道，細胞周期蛋白D1(CyclinD1)基因與甲狀腺腫瘤的出現有緊密關聯[5]。細胞周期調控基因CyclinD1表達蛋白對G1期向S期轉換有調控作用，其可致細胞增殖周期異常，從而導致腫瘤細胞凋亡受到抑制[6]。細胞凋亡存在于腫瘤發生、發展進程中，與腫瘤的生長密切相關[7]。Bcl-2相關X蛋白(Bax)是B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)基因家族中促凋亡基因的代表[8]。本試驗研究甲狀腺良惡性組織中Bax蛋白表達情況，以探索細胞凋亡所發揮的作用。PTMC細胞增殖與凋亡進程中，CyclinD1與Bax蛋白表達有無關聯，值得探索。本文應用免疫組織化學技術，探究CyclinD1和Bax蛋白表達在甲狀腺良、惡性腫瘤中發生、發展的意義，以及兩者之間有無關聯，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年6月在本院肝膽胰甲狀腺外科治療的甲狀腺疾病手術病例(有完備病例材料的病理科存檔蠟塊)。PTMC 72例(甲狀腺乳頭狀癌組)，其中頸部淋巴結轉移8例；男25例，女47例；平均年齡(45.1±8.16)歲。良性腫瘤65例全數為甲狀腺腺瘤(甲狀腺腺瘤組)，其中男20例，女45例；平均年齡(52.3±11.75)歲。癌旁甲狀腺正常組織60例(癌旁甲狀腺正常組織組)，其中男18例，女42例；平均年齡(47.6±10.55)歲。全部病例標本均經手術和病理學證實。納入標準：遵照PTMC的診斷標準腫瘤直徑小于或等于1 cm；所選組織中均帶有癌旁組織；術前無放化療和免疫治療病史。經病理檢查確診，72例PTMC未發現甲狀腺癌浸潤。標本遵照常例取材、固定、石蠟包埋，4 μm厚連續切片。

1.2 方法

1.2.1 試驗試劑 即用型CyclinD1兔抗人單克隆抗體(克隆號SP4，產品編號RMA-0541),即用型Bax鼠抗人單克隆抗體(克隆號2D2，產品編號MAB-0254),EDTA抗原修復液(pH=9.0，產品編號MVS-0098/0099),即用型快捷免疫組織化學MaxvisionTM/HRP檢測試劑盒(產品編號Kit-5030),二氨基聯苯胺法(DAB)染色試劑盒(產品編號Kit-0016)均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.2.2 試驗方法 用免疫組織化學(MaxvisionTM/HRP免疫組織化學染色法)檢測CyclinD1、Bax蛋白表達情況，嚴格遵照試劑盒說明書操作。具體操作步驟包括：(1)石蠟切片脫蠟、水化，自來水沖洗；(2)抗原EDTA熱修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，每次3 min；(3)3%的雙氧水孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；(4)去除PBS，切片上滴加第一抗體，4 ℃過夜，PBS沖洗3次，每次3 min；(5)去除PBS，切片上滴加MaxvisionTM/HRP試劑，室溫孵育15 min，PBS沖洗3次，每次3 min；(6)去除PBS，切片上滴加新鮮配制的DAB顯色試劑顯色；(7)自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，1%鹽酸乙醇分化，PBS返藍，切片經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。以PBS替換一抗作為陰性空白對照，以邁新生物公司提供的陽性對照切片做陽性對照。

1.2.3 試驗判定標準 用已知陽性片作為陽性對照，PBS緩沖液替換一抗當作陰性對照。每一張切片選取有意義的10個高倍鏡視野，每單個視野統計100個腫瘤細胞中的陽性細胞數量。由病理科兩位醫生用雙盲的方法，對所有的片子進行觀察。CyclinD1陽性指細胞核中呈現出淡黃、棕黃或棕褐色顆粒，不著色或著色淺且不特異者為(一)。以陽性細胞或陽性細胞數小于10%為(一)，以陽性細胞數大于或等于10%為(+)。Bax陽性指細胞膜和(或)細胞質中呈現出淡黃、棕黃或棕褐色顆粒，不著色或著色淺且不特異者為(一)。以陽性細胞或陽性細胞數小于10%為(一)，以陽性細胞數大于或等于10%為(+)。

1.3 統計學處理 運用SPSS 17.0軟件對試驗數據實行分析統計。應用χ2檢驗和Fisher精確概率法檢驗，同時應用Pearson列聯系數分析闡明二者關聯性，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CyclinD1在甲狀腺良、惡性組織中的蛋白表達 CyclinD1陽性表達部位定位于細胞核(圖1)，其在甲狀腺乳頭狀癌組、甲狀腺腺瘤組、癌旁甲狀腺正常組織組中陽性表達率為79.17%、47.69%、0%。甲狀腺乳頭狀癌組CyclinD1蛋白表達高于甲狀腺腺瘤組(χ2=14.730，P<0.01)、癌旁甲狀腺正常組(χ2=80.404，P<0.01)；甲狀腺腺瘤組CyclinD1蛋白表達高于癌旁甲狀腺正常組織組(χ2=35.538，P<0.01)，見表1。

2.2 Bax在甲狀腺良、惡性組織中的蛋白表達 Bax陽性表達部位定位于胞膜和(或)細胞質(圖1)，其在甲狀腺乳頭狀癌組、甲狀腺腺瘤組、癌旁甲狀腺正常組織組中陽性表達率順次為66.67%、52.31%、0%。甲狀腺乳頭狀癌組Bax蛋白表達高于癌旁甲狀腺正常組織組(χ2=60.009，P<0.01)；甲狀腺乳頭狀癌組Bax蛋白表達與甲狀腺腺瘤組比較，表達差異無統計學意義(χ2=2.931，P>0.05)；甲狀腺腺瘤組Bax蛋白表達高于癌旁甲狀腺正常組織組(χ2=40.510，P<0.01)，見表1。

2.3 PTMC中CyclinD1 、Bax蛋白表達與臨床病理參數間的關系 CyclinD1蛋白的表達與患者性別、年齡、淋巴結轉移無明顯關聯性(χ2=0.016、1.317、0.024，P>0.05)。Bax蛋白的表達與淋巴結轉移的關聯性差異有統計學意義(χ2=4.598，P<0.05)，與患者性別、年齡無明顯關聯性(χ2=1.961、10.113，P>0.05)，見表2。

2.4 PTMC中CyclinD1與Bax蛋白表達的相關性 PTMC中，Pearson分析檢測得出CyclinD1和Bax蛋白表達呈正相關關聯(P<0.01)，見表3。

A:Bax蛋白在PTMC中表達;B：CyclinD1蛋白在PTMC中表達;C:Bax蛋白在甲狀腺腺瘤中表達;D:CyclinD1蛋白在甲狀腺腺瘤中表達。

圖1 MaxvisionTM/HRP免疫組織化學染色法(×200) 表1 CyclinD1和Bax蛋白在3組中表達

表2 PTMC中CyclinD1 、Bax蛋白表達與臨床病理參數間的關系

表3 PTMC中CyclinD1與Bax蛋白表達的相關性分析

3 討 論

環境與遺傳中的致癌因素，以共同或者序貫的方式對細胞基因組DNA產生非致命的打擊損傷。一定程度上DNA的損傷，能激活原癌基因和引起凋亡基因的異常表達，從而導致靶細胞產生紊亂變化。損傷基因組DNA未及時修復，突變基因積累可致細胞癌變[9]。原癌基因是細胞增生、分化的重要調控元件,如細胞周期調控蛋白CyclinD1[10]。CyclinD1是由CCNDI基因編碼的原癌基因，基因定位于染色體11q13，全長約120 kbp，編碼295個氨基酸構成的蛋白質，相對分子質量為34×103[11]。細胞周期調控蛋白CyclinD1通過與CDK4或CDK6結合形成CyclinD1-CDK4或CyclinD1-CDK6復合物,該復合物磷酸化關鍵底物Rb基因，Rb結合的轉錄因子E2F獲得釋放[12]，調控加速G1向S期轉變的進程，增強DNA轉錄,致細胞周期縮短,細胞增殖速度加快[13]。

司海燕等[5]研究CyclinD1蛋白表達在甲狀腺乳頭狀癌(79.2%)、甲狀腺良性病變(27.5%)、正常甲狀腺組織(0%)中的結果與本試驗結果基本一致。 CyclinD1蛋白在甲狀腺腫瘤組織中表達較強，提示甲狀腺腫瘤組織較甲狀腺正常組織的細胞增殖速度快。甲狀腺乳頭狀癌組CyclinD1蛋白表達高于甲狀腺腺瘤組、癌旁甲狀腺正常組織組；甲狀腺腺瘤組CyclinD1蛋白表達高于癌旁甲狀腺正常組織組，提示細胞增殖速度隨著甲狀腺組織惡性程度增加而增快。CyclinD1蛋白的表達與PTMC患者年齡、性別、淋巴結轉移無明顯關聯性，張曉亮等[10]報道未發現CyclinD1蛋白與臨床病理參數間的關系，與本試驗結果基本一致，提示CyclinD1蛋白表達與PTMC的發生、發展密切相關。

腫瘤的出現，除去原癌基因的驅動,細胞凋亡基因的反常表達也有著關鍵性的作用。Bax基因是Bcl-2基因家族中的促凋亡基因，Bcl-2基因則抑制細胞凋亡。正常細胞內Bcl-2和Bax保持動態平衡，如Bcl-2基因表達蛋白相對增多，細胞處于存活狀態；相反，Bax基因表達蛋白相對增多，細胞將要開啟細胞凋亡閘門。細胞接受信號刺激后，Bax/Bcl-2的比值變化對細胞繼續存活或者凋亡，起著關鍵性的作用[14]。(1)Bax蛋白將從細胞質遷徙到線粒體，以BH3結構域識別線粒體膜上Bcl-2蛋白，聯系產生非同源二聚體，起抗凋亡的效用；(2)游離的Bax蛋白互相聯系產生同源二聚體，并從胞液遷徙到線粒體膜上，插入線粒體外膜后并形成孔道，增加線粒體膜的滲透性，促進細胞色素C釋放到細胞質，并開啟細胞凋亡程序閘門，激活下游Caspase瀑布反應，最終致細胞凋亡[15]。因此，Bax基因是凋亡途徑中的關鍵控件。

本試驗蛋白陽性表達率與成克倫[16]報道Bax蛋白表達在甲狀腺癌、甲狀腺腺瘤中的結果基本一致。Bax蛋白在甲狀腺腫瘤組織中表達較強，提示甲狀腺腫瘤組織較甲狀腺正常組織的細胞凋亡速度快。甲狀腺乳頭狀癌組Bax蛋白表達高于癌旁甲狀腺正常組織組；甲狀腺乳頭狀癌組Bax蛋白表達與甲狀腺腺瘤組比較，表達差異無統計學意義(P>0.05)；甲狀腺腺瘤組Bax蛋白表達高于癌旁甲狀腺正常組織組。甲狀腺乳頭狀癌組與甲狀腺腺瘤組中Bax蛋白表達較強，且甲狀腺乳頭狀癌組與甲狀腺腺瘤組無明顯差異，癌旁甲狀腺正常組織組無表達；說明甲狀腺乳頭狀癌組與甲狀腺腺瘤組凋亡速度差異無明顯，甲狀腺腫瘤組織較甲狀腺正常組織的細胞凋亡速度快。提示Bax蛋白表達與PTMC的發生、發展相關。Bax蛋白的表達與PTMC患者淋巴結轉移有關聯，與患者年齡、性別無明顯關聯性，提示Bax蛋白表達與PTMC的發生、發展、侵襲轉移相關。

在PTMC中CyclinD1和Bax蛋白高表達，且CyclinD1和Bax蛋白表達呈正相關關聯，提示兩者可能共同參與PTMC的發生、發展進程。甲狀腺腫瘤細胞生長到一定程度，其增殖和凋亡維持相對平衡，高度惡性腫瘤細胞增殖速度增快，其凋亡速度亦增快[17]。然而，CyclinD1和Bax基因的具體協同作用機制，目前還未闡明，需要下一步繼續深入探究。

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Expression and significance of CyclinD1 and Bax in papillary thyroid microcarcinoma*

WeiGuangmin1,ZhouWenbo1△,WuLun1,WeiYing2,ZhangRui3

(1.DepartmentofLiverGallbladderPancreasThyoidSurgery;2.DepartmentofExperimentalCenter;3.DepartmentofPathology,AffiliatedDongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan,Hubei442000,China)

Objective To explore the expression and value of CyclinD1 and Bax in papillary thyroid microcarcinoma.Methods The paraffin embedded specimens of thyroid diseases archived in the pathology department of our hospital from January 2014 to June 2015 were randomly selected.Expression of CyclinD1 and Bax were detected in 72 cases of papillary thyroid microcarcinoma,60 cases of paracancerous normal tissue and 65 cases of adenoma by using the monoclone antibody rabbit anti-CyclinD 1 and rat anti-Bax labeling.Results The positive rate of CyclinD1 protein expression in papillary thyroid microcarcinoma was 79.17%,the difference in the expression between adenoma tissue and paracancerous normal tissue was statistical significant (χ2=80.404,χ2=14.730,P<0.01),which had no obvious correlation with the patient′ s age,gender and lymph node metastasis(P>0.05).The positive rate of Bax protein expression in papillary thyroid microcarcinoma was 66.67%,its difference with adenoma was not obvious(P>0.05),but its difference with paracancerous normal tissue had statistical significance(P<0.01),which had correlation with lymph node metastasis(χ2=4.598，P<0.05),while had no obvious correlation with the patient′ s age and gender(P>0.05).The CyclinD1 expression in papillary thyroid microcarcinoma was positively correlated with the Bax protein expression (χ2=11.463,r=0.435,P<0.01).Conclusion CyclinD1 and Bax protein are highly expressed in papillary thyroid microcarcinoma,which is related with the occurrence and development of papillary thyroid microcarcinoma.Their combined detection is conducive to diagnose papillary thyroid microcarcinoma.

papillary thyroidmicrocarcinoma;Cyclind1;Bax;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.012

湖北省科學技術研究與開發項目(2014CFB310)；湖北省教育廳青年人才項目(Q20162112)。 作者簡介：魏廣民(1987-)，住院醫師，在讀碩士，主要從事肝膽胰甲狀腺外科方面研究。△

R736.1

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1671-8348(2017)03-0325-04

2016-07-06

2016-09-30)