橄欖苦苷對脂多糖誘導的小鼠急性肝損傷的保護效應(yīng)*

胡光強,袁 園,杜 曦,李永杰,余 錄△

(西南醫(yī)科大學：1.基礎(chǔ)醫(yī)學院;2.藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州 646000)

論著·基礎(chǔ)研究

橄欖苦苷對脂多糖誘導的小鼠急性肝損傷的保護效應(yīng)*

胡光強1,袁 園1,杜 曦1,李永杰2,余 錄1△

(西南醫(yī)科大學：1.基礎(chǔ)醫(yī)學院;2.藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州 646000)

目的 觀察橄欖苦苷對脂多糖(LPS)誘導的小鼠急性肝損傷的保護作用。方法 雄性ICR小鼠被分為正常對照組、LPS組、橄欖苦苷低劑量組(15 mg/kg),橄欖苦苷中劑量組(30 mg/kg)，橄欖苦苷高劑量組(45 mg/kg)及甘利欣組(甘草酸二銨注射液，11.25 mg/kg)。LPS(10 mg/kg)腹腔注射制作急性肝損傷模型，橄欖苦苷及甘利欣均于LPS注射后1 h和3 h尾靜脈給予，正常對照組給予等量的生理鹽水。6 h后處死所有小鼠，用稱質(zhì)量法計算肝臟指數(shù)，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肝臟組織病理學變化，免疫組織化學染色法檢測肝組織腫瘤壞死因子(TNF-α)及細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達。結(jié)果 肝臟指數(shù)：橄欖苦苷高劑量組、中劑量組及甘利欣組較LPS組明顯降低(P<0.05)；染色結(jié)果：高劑量和中劑量的橄欖苦苷及甘利欣組減輕LPS誘導的小鼠肝臟病理學損傷程度。與LPS組比較，橄欖苦苷高劑量組、中劑量組及甘利欣組TNF-α和ICAM-1的表達顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 橄欖苦苷對LPS所致的小鼠急性肝損傷具有顯著的保護作用,其機制可能與阻止肝臟炎性反應(yīng)有關(guān)。

橄欖；肝臟；創(chuàng)傷和損傷；急性病；脂多糖類；急性肝損傷；橄欖苦苷

肝臟是人體最大的消化腺，是體內(nèi)新陳代謝的核心場所，也是內(nèi)毒素最易致?lián)p的靶器官之一。內(nèi)毒素是革蘭陰性細菌細胞壁中的一種成分，其主要成分脂多糖(lipopolysacchide,LPS)在肝臟疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。橄欖苦苷，一種在橄欖葉中含量極高并易于分離純化的生物活性物質(zhì)，具有消炎、抗病毒、防癌等多種藥理學效應(yīng)[2]。本實驗采用LPS腹腔注射致小鼠急性肝臟炎癥模型，觀察橄欖苦苷的保護作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性ICR小鼠，體質(zhì)量25～30 g，購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑與儀器 橄欖苦苷由成都曼斯特生物科技有限公司提供，純度：高效液相色譜法(HPLC)≥98%；LPS(from Escherichia coli 0111:B4，Sigma公司)；甘利欣注射液購自江蘇正大天晴藥業(yè)股份有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)單克隆抗體、鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。儀器還有梅特勒LE104E電子天平(梅特勒托利多，瑞士)，奧林巴斯BX60顯微鏡(奧林巴斯，日本)，Leica CM 1950冰凍切片機(徠卡公司，德國)及Image-pro Plus 6.0圖像分析軟件(Media Cybernetics，美國)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及動物模型制作 小鼠分為正常對照組、LPS組、橄欖苦苷低劑量組(15 mg/kg)，橄欖苦苷中劑量組(30 mg/kg)，橄欖苦苷高劑量組(45 mg/kg)及甘利欣組。甘利欣組以11.25 mg/kg的劑量給藥(按成人用藥量換算成小鼠等效劑量)，每組13只。LPS(10 mg/kg)腹腔注射給予，橄欖苦苷和甘利欣于LPS注射后1、3 h尾靜脈注射給予，正常對照組及LPS組給予等量生理鹽水。

1.2.2 肝臟指數(shù)檢測 LPS注射后6 h,每組8只小鼠麻醉后處死，取肝臟用濾紙將表面吸干，電子分析天平稱其濕質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

1.2.3 組織病理學觀察 將小鼠麻醉后，分別用冰凍磷酸鹽緩沖液(PBS)和多聚甲醛灌流，取肝臟右側(cè)中葉同一部位甲醛固定24 h，置于15%的蔗糖溶液中過夜，次日標本沉底后，換30%的蔗糖溶液浸泡，4 ℃冰箱保存，擇日用聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物(optimal cutting temperature compound，OCT)包埋、冰凍切片，用于蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組織化學染色。

1.2.4 HE染色 切片置于50 ℃烤箱4 h,蒸餾水洗5 min，3次，然后蘇木素染色2 min，流水沖洗，1%鹽酸乙醇分化1～3 s，蒸餾水洗5 min×3次，伊紅液染色1～3 min，蒸餾水稍洗后80%、95%乙醇及無水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，烤干后封片。400倍光鏡下取肝組織同一區(qū)域3個不同的視野采圖，觀察肝臟病理學改變情況。

1.2.5 免疫組織化學染色 切片用蒸餾水洗5 min×3次，3%H2O2甲醇液避光孵育20 min，蒸餾水清洗，枸櫞酸緩沖液微波抗原修復，冷卻后pH7.2的PBS洗5 min×3次，滴加牛血清清蛋白(BSA)，于37 ℃孵育40 min，甩干后滴加稀釋的一抗(TNF-α 1∶100；ICAM-1 1∶200)于濕盒內(nèi)4 ℃過夜，次日取出后置于室溫1 h。PBS沖洗，加羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)孵育1 h，SABC孵育1 h，然后DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明及封片。400倍光鏡下取肝組織同一區(qū)域3個不同的視野采圖，記錄每高倍視野TNF-α陽性表達數(shù)，用Image proplus 6.0軟件計算ICAM陽性表達的累積光密度值(IOD)與面積的比值。

2 結(jié) 果

2.1 橄欖苦苷對LPS誘導的ICR小鼠肝臟指數(shù)的影響 正常對照組小鼠肝指數(shù)為(4.72±0.35)%，LPS組小鼠肝臟指數(shù)明顯升高，為(5.38±0.38)%，兩組比較，肝臟指數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。而橄欖苦苷高劑量組肝臟指數(shù)為(4.84±0.21)%，甘利欣組肝臟指數(shù)為(4.86±0.20)%，兩組較LPS組小鼠肝臟指數(shù)均有明顯降低(P<0.01)。橄欖苦苷中劑量肝臟指數(shù)為(4.98±0.34)%，較LPS組也有降低(P<0.05)；低劑量橄欖苦苷組肝臟指數(shù)為(5.25±0.39)%，雖然有所降低，但與LPS組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 橄欖苦苷對LPS誘導的ICR小鼠肝臟組織病理學檢查的影響 在400倍光鏡下，正常對照組小鼠肝細胞結(jié)構(gòu)清晰，細胞間間隙緊密均勻，未見細胞水腫、變性壞死等病理現(xiàn)象；LPS組小鼠肝臟中央靜脈擴張，肝細胞腫脹、空泡變性，個別肝細胞出現(xiàn)壞死，細胞間間隙變寬、排列紊亂；橄欖苦苷中劑量和高劑量組較LPS組肝細胞炎性水腫程度減輕，細胞間間隙變緊密,排列相對均勻；甘利欣組病理現(xiàn)象也有明顯改善；而橄欖苦苷低劑量組對LPS導致的肝臟病理損傷沒有明顯改善，見圖1。

2.3 橄欖苦苷對LPS誘導的ICR小鼠肝臟組織TNF-α和ICAM-1表達的影響 正常對照組肝臟幾乎沒有TNF-α陽性表達，但在LPS誘導組，大鼠肝細胞質(zhì)可見大量棕褐色TNF-α陽性顆粒表達，肝細胞呈深染色。橄欖苦苷各組TNF-α陽性顆粒較LPS組表達呈劑量依賴性減少(P<0.05)；甘利欣組TNF-α陽性表達數(shù)量也明顯減少，且肝細胞染色變淺，與LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖2。另外，正常對照組肝臟僅有極少ICAM-1陽性表達，但LPS組可見明顯的ICAM-1棕黃色強陽性表達，其表達主要出現(xiàn)在肝竇內(nèi)皮細胞、肝實質(zhì)細胞；橄欖苦苷高劑量和中劑量組中ICAM-1陽性表達減少，僅有肝竇內(nèi)皮細胞可見，且染色程度減輕；甘利欣組肝組織ICAM-1陽性表達也明顯減輕。統(tǒng)計學結(jié)果表明，橄欖苦苷中、高劑量組及甘利欣組小鼠ICAM-1陽性細胞表達的IOD與面積比值與LPS組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖3。

A:正常對照組；B:LPS組；C：橄欖苦苷低劑量組；D:橄欖苦苷中劑量組；E:橄欖苦苷高劑量組；F:甘利欣組。

圖1 橄欖苦苷對LPS誘導的ICR小鼠肝臟組織病理學檢查的影響(HE，×400)

A:正常對照組；B:LPS組；C：橄欖苦苷低劑量組；D:橄欖苦苷中劑量組；E:橄欖苦苷高劑量組；F:甘利欣組。

圖2 各組小鼠肝臟組織TNF-α表達(免疫組織化學，×400)

A:正常對照組；B:LPS組；C：橄欖苦苷低劑量組；D:橄欖苦苷中劑量組；E:橄欖苦苷高劑量組；F:甘利欣組。

圖3 各組小鼠肝臟組織ICAM-1的表達(免疫組織化學，×400) 表1 橄欖苦苷對LPS誘導的ICR小鼠肝臟組織 TNF-α和ICAM-1表達的影響

a：P<0.05，b：P<0.01,與LPS組比較。

3 討 論

肝臟是人體非常重要的器官，承擔著解毒、代謝及免疫防御等功能[3]。在病毒或內(nèi)毒素刺激的情況下，肝臟細胞特別是Kupeff細胞及肝竇內(nèi)皮細胞大量增殖，合成并釋放炎性細胞因子、細胞黏附分子，參與白細胞-肝竇內(nèi)皮細胞間的黏附和跨內(nèi)皮遷移，進一步促進炎性反應(yīng)的病理過程，從而加重肝損傷[4]。研究表明，LPS與細胞膜上的受體結(jié)合后，激活肝內(nèi)外單核-巨噬細胞系統(tǒng),通過其上調(diào)核因子κB(NF-κB)、P38及JAK/STAT等炎性信號通路,增加致炎因子的表達，形成瀑布級聯(lián)效應(yīng)從而損傷肝臟[5-7]。

眾所周知，橄欖油因具有強大的抗氧化作用而廣泛運用于美容、醫(yī)療界。而隨著研究的不斷深入與發(fā)展，橄欖苦苷作為橄欖葉中含量較多的苯酚類裂環(huán)環(huán)烯醚帖苷化合物，其具有無毒、易被人體吸收等優(yōu)勢，其藥理學效應(yīng)也逐漸被重視[8]。有研究表明，橄欖苦苷對HepG2 2.2.15細胞乙型肝炎表面抗原(HbsAg)的表達呈劑量依賴性抑制作用，且體內(nèi)研究表明其具有抗鴨乙型肝炎病毒(DHBV-DNA)的作用，但其作用機制尚未明確[9]。這為橄欖苦苷在肝臟疾病的治療研究提供了契機。

本研究以LPS為誘導制作肝臟急性損傷模型，觀察橄欖苦苷的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹腔注射LPS導致肝臟的炎性水腫、空泡變性等病理損傷，且肝臟指數(shù)明顯升高，說明LPS成功誘導了肝臟急性損傷。進一步研究發(fā)現(xiàn)，模型組也顯示作為炎性標志的TNF-α和ICAM-1在肝臟組織中有較高的表達，說明LPS增加了致炎因子的表達，從而導致了病理改變。臨床研究證實，肝炎患者血清中往往存在高水平TNF-α、ICAM-1表達，而且，在慢性肝病中，ICAM-1在肝組織和血清中表達呈相關(guān)性增強[10]，這與本研究結(jié)果契合。而本研究給予中劑量和高劑量的橄欖苦苷，不僅在一定程度上減輕了LPS導致的肝臟病理損傷程度，且肝臟組織切片TNF-α、ICAM-1的陽性表達也有明顯的下調(diào)，說明橄欖苦苷對LPS導致的肝損傷有一定的保護效應(yīng)，其作用可能是通過抑制炎性因子及黏附分子的表達，阻止炎癥瀑布級聯(lián)反應(yīng)，但更深的機制還需進一步的研究。

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Protective effects of oleuropein on acute liver injury induced by lipopolysacchide in mice*

HuGuangqiang1,YuanYuan1,DuXi1,LiYongjie2,YuLu1△

(1.CollegeofBasicMedicine;2.ResearchCenterofDrugsandFunctionalFoods,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To observe the protective effects of oleuropein on actue liver injury induced by lipopolysacchide(LPS) in mice.Methods Male ICR mice were divided into the normal control group,LPS group,oleuropein high dose(45 mg/kg),medium dose (30 mg/kg) and low(15 mg/kg) dose groups and Ganlixin (glycyrrhizic acid diammonium injection,11.25 mg/kg) group.Mice were intraperitoneally injected with LPS(10 mg/kg) to establish the model of liver injury,then mice were intravenously given oleuropein and Ganlixin by tail vein at 1,3 h after LPS injection.Subsequently,all mice were sacrificed at 6 h,the liver index was calculated by weighing method,the pathologic changes were observed by HE staining,and the expressions of TNF-α and ICAM-1 were detected by immunohistochemical techniques.Results The liver index:compared with the LPS group,the liver index in the oleuropein high and medium doses groups and Ganlixin group were significantly decreased (P<0.05);the staining results：the oleuropein high and medium doses groups and Ganlixin group reduced the liver pathology damage degree induced by LPS;the expression of TNF-α and ICAM-1 in the oleuropein high and medium doses groups and Ganlixin group were significantly down-regulated compared with the LPS group (P<0.05).Conclusion Oleuropein has remarkable protective effect on mice acute liver injury induced by LPS,its mechanism may be associated with blocking the liver inflammatory reaction.

canarium album;liver;wounds and injuries;acute disease;lipopolysaccharides;acute liver injury;oleuropein

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.008

省-市-校聯(lián)合基金項目(14JC0120)；四川省教育廳基金項目(14ZB0152)。 作者簡介:胡光強(1970-)，副教授，本科，主要從事神經(jīng)解剖學方面研究。△

R575；R966

A

1671-8348(2017)03-0312-03

2016-07-26

2016-10-22)