細胞穿透肽VP22對抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用影響的研究*

李婷婷，楊 勤，余 嫻，何冠軍，雷 軍△

(1.川北醫學院麻醉學系，四川南充 637000；2.川北醫學院附屬醫院感染科，四川南充 637000；3.重慶醫科大學附屬第二醫院藥學部，重慶 400010；4.川北醫學院藥學院，四川南充 637000)

論著·基礎研究

細胞穿透肽VP22對抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用影響的研究*

李婷婷1，楊 勤2，余 嫻3，何冠軍4，雷 軍4△

(1.川北醫學院麻醉學系，四川南充 637000；2.川北醫學院附屬醫院感染科，四川南充 637000；3.重慶醫科大學附屬第二醫院藥學部，重慶 400010；4.川北醫學院藥學院，四川南充 637000)

目的 構建表達細胞穿透肽融合蛋白第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)-VP22的真核表達質粒，在食管癌細胞Eca109細胞中驗證細胞穿透肽VP22能否增強抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用。方法 通過本實驗室前期構建成功的重組真核表達質粒pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22和pcDNA3-VP22，轉染至Eca109細胞，以pcDNA3空質粒轉染作為陰性對照，細胞免疫熒光法檢測各組PTEN蛋白表達情況，Western blot法檢測各組PTEN蛋白和免抗磷酸化-Akt(p-Akt)蛋白的表達水平，CCK-8法檢測細胞增殖活性,流式細胞術測細胞凋亡率。結果 與pcDNA3相比，pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22都能抑制Eca109細胞增殖(P<0.05)，促進Eca109細胞凋亡(P<0.05)；pcDNA3-PTEN-VP22抗腫瘤活性顯著高于pcDNA3-PTEN(P<0.05)，pcDNA3-PTEN-VP22的p-Akt表達顯著低于pcDNA3-PTEN(P<0.05)。結論 細胞穿透肽VP22能增強抑癌蛋白PTEN對Eca109細胞體外抗腫瘤活性，其機制可能與其下調p-Akt表達水平有關。

食管腫瘤；腫瘤蛋白質類；重組融合蛋白質類；轉染；肽類；PTEN；VP22；基因治療

食管癌是全球常見的十大惡性腫瘤之一，我國食管癌發病率、病死率高居榜首[1-2]。研究發現第10號染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)表達下調與食管癌細胞分化程度、浸潤深度及淋巴結轉移密切相關[3-5]，但基因轉導效率低阻礙了腫瘤基因治療的應用。1型單純皰疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)間層蛋白VP22是一種高效的細胞穿透肽，研究已經報道了VP22能介導抑癌蛋白P27、P53在細胞間轉運，并顯示出對多種腫瘤細胞顯著的抗腫瘤活性[6-7]。本研究通過構建PTEN/VP22融合蛋白真核表達質粒，驗證VP22能否增強PTEN的轉運和表達，為研究體內治療奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 真核表達質粒pcDNA3由本實驗室保存，購自美國Invitrogen公司；pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22、pcDNA3-VP22由本實驗室構建并保存[8]；人食管癌細胞Eca109由川北醫學院分子生物學研究所惠贈；Lipofectamine 2000脂質體購自美國invitrogen公司；兔抗PTEN單克隆抗體購自美國abcam公司；兔抗磷酸化-Akt((p-Akt)單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗兔IgG、HRP標記羊抗小鼠IgG、鼠抗β-actin購自Beyotime公司；異硫氰酸熒光素(FITC)-羊抗兔IgG購自武漢博士德公司；二氨基聯苯胺(DAB)辣根過氧化物酶顯示試劑盒、CCK-8試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)凝膠配置試劑盒購自Beyotime公司；細胞凋亡Annexin V/碘化丙啶(PI)試劑盒購自聯科生物。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 將Eca109細胞培養在含10%熱滅活的胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，在37 ℃、含5%CO2的孵箱中孵育。

1.2.2 試驗分組和細胞轉染 (1)試驗分為4組，PTEN組、PTEN-VP22組、試驗組(VP22組)，對照組(pcDNA3組)。(2)細胞轉染：取對數生長期的Eca109細胞接種于相應的培養板中，待細胞長至50%～70%融合時更換無血清培養基，按lipofectamine2000說明書步驟進行轉染，同時用熒光標記的質粒pEGFP-N1轉染目的細胞，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。

1.2.3 細胞免疫熒光檢測PTEN蛋白的表達 待24孔板中細胞長至50%～70%融合時按每孔轉染0.5 μg DNA，48 h后用含多聚甲醛免疫染色固定液固定10 min，含Triton X-100免疫染色洗滌液透化5 min，共兩次，rabbit anti-PTEN(1∶100) 一抗4 ℃過夜封閉，次日加入FITC標記的羊抗兔IgG(1∶50稀釋)，37 ℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察PTEN蛋白的表達，并用熒光酶標儀檢查熒光光密度(OD)值。

1.2.4 Western blot檢測PTEN蛋白和p-Akt蛋白的表達 待25 cm2細胞培養瓶中細胞生長至50%～70%融合時按上述方法每瓶轉染10 μg DNA，48 h后用預冷刮刀刮取細胞至EP管中離心，加入50 μL裂解液(1 mmol/L PMSF) 4 ℃持續振搖裂解30 min后離心，上清液即為所提蛋白。按照碧云天二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒步驟測定蛋白濃度，與5×蛋白上樣緩沖液按照5∶1的比例混勻，沸水中加熱5 min充分變性，進行10%SDS-PAGE分離后轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，Western封閉液1 h，一抗4 ℃搖床過夜孵育，二抗室溫孵育1 h，DAB顯色，用Image-labe軟件讀取各組條帶灰度值。

1.2.5 CCK-8法細胞增殖活性檢測 取對數生長期細胞，以每孔1×104/100 μL接種到96孔板，當細胞生長至50%融合時，分別用4組質粒轉染，設置5個濃度梯度，即1、2、3、4、5 μg/mL，每組每個濃度設置3個復孔，分別培養24、48、72 h后按CCK-8試劑說明書進行OD值的檢測。

1.2.6 流式細胞術測細胞凋亡率 待6孔板中的細胞長至50%～70%融合時每孔轉染2.5 μg DNA，48 h后加入不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶(0.25%)消化，1 200 r/min離心5 min收集1×105/管細胞沉淀，500 μL 1×binding buffer重懸細胞，加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室溫暗室孵育5 min，400目篩網過濾后，用流式細胞儀進行檢測，Winmdi軟件分析細胞凋亡率。

2 結 果

2.1 細胞免疫熒光檢測PTEN蛋白和PTEN-VP22融合蛋白的表達情況 分別用4組質粒轉染Ec109細胞48 h后，細胞免疫熒光檢測發現PTEN組和PTEN-VP22組可見發綠色熒光細胞，PTEN-VP22組綠色熒光蛋白的量明顯多于PTEN組，pcDNA3組和VP22組未見發綠色熒光的細胞(圖1)。通過熒光定量酶標儀對各組綠色熒光蛋白的OD值進行測量，發現PTEN組和PTEN-VP22組OD值明顯高于pcDNA3組(P<0.05)，PTEN-VP22組OD值明顯高于PTEN組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

A:PTEN組；B:PTEN-VP22組；C:pcDNA3組；D:VP22組。

圖1 細胞免疫熒光檢測PTEN蛋白在不同質粒轉染組的表達情況(×20)

*：P<0.05，與pcDNA3組比較；#：P<0.05，與PTEN組比較。

圖2 各轉染組PTEN熒光蛋白定量OD值

2.2 Western blot檢測目的蛋白的表達情況 Western blot 結果顯示PTEN和PTEN-VP22組分別檢測到相對分子質量為54×103的PTEN蛋白和相對分子質量為90×103的PTEN-VP22融合蛋白的特異性條帶(圖3)。和pcDNA3組相比，PTEN組和PTEN-VP22組p-Akt蛋白的表達減少(P<0.05)，PTEN-VP22組p-Akt蛋白灰度值低于PTEN組(P<0.05)，差異具有統計學意義，見圖4、5。

1:PTEN組；2:PTEN-VP22組；3:pcDNA3組；4:VP22組。

圖3 Western blot檢測各轉染組PTEN、PTEN-VP22蛋白表達情況

1:pcDNA3組；2：PTEN組；3:PTEN-VP22組；4:VP22組。

圖4 Western blot 檢測 p-Akt蛋白在各轉染組中的表達水平

*：P<0.05，與pcDNA3組比較；#：P<0.05，與PTEN組比較。

圖5 Western blot分析p-Akt蛋白在不同質粒轉染組中表達水平

2.3 CCK-8檢測4組質粒對Eca109細胞增殖活性的影響 與pcDNA3組相比，PTEN-VP22組和PTEN組Eca109生長呈現抑制作用(P<0.05)，其抑制作用具有時間、濃度依賴性，PTEN-VP22組在0.5 μg/mL處開始，較PTEN組出現顯著地抑制細胞增殖的活性(P<0.05)，作用48 h后在0.5 μg/mL濃度處其抑制率接近50%，而VP22對Eca109的生長未表現出抑制作用(P>0.05)，見圖6。

A:作用48 h時不同濃度藥物對細胞的生長抑制曲線；B:0.5 μg/mL藥物作用不同時間對細胞的生長抑制曲線。

圖6 CCK-8檢測各組細胞增殖活性

2.4 Annexin V/PI雙染法檢測4組質粒對Eca109細胞凋亡的影響 PTEN組、PTEN-VP22組、VP22組細胞凋亡率分別為(30.66±0.99)、(69.55±0.38)%和(7.86±0.13)%，pcDNA3組凋亡率為(7.65±0.28)%。和pcDNA3組相比，PTEN組、PTEN-VP22組凋亡率明顯升高(P<0.05)，并且PTEN-VP22組凋亡率也明顯高于PTEN組，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖7、8。

A:PTEN組；B:PTEN-VP22組；C:pcDNA3組；D:VP22。

圖7 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡

*：P<0.05，與pcDNA3組比較；#：P<0.05，與PTEN組比較。

圖8 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡

3 討 論

PTEN基因定位于人類染色體10q23.3，全長200 kb，有9個外顯子和8個內含子，編碼的PTEN蛋白含有403個氨基酸。PTEN的基因產物是一種多功能蛋白，具有脂質磷酸酶活性，可對抗磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)調控的細胞生長因子信號轉導通路，降低脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate,PIP3)水平，抑制腫瘤細胞的增殖、促進凋亡[8-9]。根據PTEN基因及其表達產物結構和PTEN在其他腫瘤表達下調機制的研究，發現PTEN基因遺傳學及表觀遺傳學異常導致食管癌中PTEN表達減少[10]。本研究通過外源性導入表達PTEN蛋白的重組質粒，結果發現PTEN重組質粒能在Eca109細胞中表達PTEN蛋白，發揮抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡的作用，這與李菲[11]研究的轉染 PTEN 質粒對食管癌細胞增殖具有一定的抑制作用的報道一致。

研究已經證實，VP22融合蛋白能夠介導治療蛋白在相鄰的細胞間進行轉運，從而達到治療性蛋白發揮功效的水平，在整體上發揮生物學效應。本研究將重組質粒pcDNA3-PTEN、pcDNA3-PTEN-VP22用脂質體介導的基因轉染方法轉入細胞后進行免疫熒光實驗，結果發現PTEN-VP22組PTEN綠色熒光蛋白的表達量明顯高于PTEN組，說明VP22確實能夠介導PTEN蛋白在細胞間轉運，增加PTEN蛋白的表達和分布，VP22介導蛋白的轉運機制大體是通過高爾基體依賴的途徑將其蛋白從最初轉染的細胞分泌，并且非常高效地轉運至鄰近的細胞[12]。同時，本研究觀察到PTEN/VP22蛋白主要在細胞質表達，細胞核也有少量的表達，這和PTEN蛋白的表達一致，所以VP22并不改變PTEN蛋白在細胞中的定位，這就決定了PTEN和其他只在細胞核發揮作用的腫瘤抑制基因不一樣，PTEN在調節細胞質和細胞核的功能上都發揮著重要作用[13]。

大量研究發現PTEN的基因產物是一種具有蛋白和脂類雙重磷酸酶活性的抑癌蛋白，并且大多數腫瘤相關PTEN基因的突變都聚集在磷酸酶結構域，提示PTEN磷酸酶活性在控制腫瘤的發生中起著重要的作用。PTEN蛋白能夠使局部黏著斑激酶(FAK)、Shc信號分子去磷酸化，FAK是調節細胞與細胞間黏附的關鍵分子，Shc與細胞的擴散和遷移調控有關。PTEN的脂質磷酸酶活性在調控PI3K細胞增殖信號通路中發揮著重要作用，同時PTEN也能抑制PI3K下游目標絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt/PKB)活性，此活性被認為是PTEN抗腫瘤作用的關鍵[14]。研究還發現PTEN過表達會減少Akt信號通路的激活，使其下游作用分子p-Akt表達量下降[15]。本試驗發現PTEN-VP22和PTEN組中p-Akt蛋白的量低于陰性對照組和空白對照組，PTEN-VP22組蛋白水平又低于PTEN組，說明抑癌蛋白PTEN確實能減少p-Akt蛋白表達水平，同時VP22能增強PTEN-VP22融合蛋白表達，并且保留PTEN蛋白的生物學活性，即負性調控PI3K/Akt信號通路，降低Akt的磷酸化水平，從而發揮抑癌活性。

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Research on influence of cell penetrating peptides VP22 on in vitro anti-tumor effect of tumor suppressor protein PTEN*

LiTingting1,YangQin2,YuXian3,HeGuanjun4,LeiJun4△

(1.DepartmentofAnesthesiology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;2.DepartmentofInfectiousDisease,AffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;3.DepartmentofPharmacy,SecondAffiliatedHospital,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China;4.CollegeofPharmacy,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

Objective To construct the eukaryotic expression plasmid of cell penetrating peptides fusion protein PTEN-VP22 and to verify whether cell penetrating peptides VP22 could enhance the in vitro anti-tumor effect of tumor suppressor protein PTEN in esophageal cancer Eca109 cells.Methods The recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3-PTEN,pcDNA3-PTEN-VP22 and pcDNA3-VP22 constructed by our laboratory at earlier stage were transfected into Eca109 cells respectively,and the cells transfected with empty plasmid pcDNA3 were used as negative control group.Immunofluorescence was used to detected the expression of PTEN protein in each group and PTEN-VP22 fusion protein,Western blot were used to determine the expression levels of PTEN and p-Akt protein,the cell proliferation activities were measured by CCK-8 method and the cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry.Results Compared with the pcDNA3 control group,the pcDNA3-PTEN group and pcDNA3-PTEN-VP22 group both inhibited the proliferation of Eca109 cells(P<0.05) and promoted the apoptosis of Eca109 cells(P<0.05) and the anti-tumor activities in pcDNA3-PTEN-VP22 group was significantly higher than that in the pcDNA3-PTEN group(P<0.05).The expression level of p-Akt in the pcDNA3-PTEN-VP22 group was significantly lower than that in the pcDNA3-PTEN group(P<0.05).Conclusion The cell penetrating peptides VP22 can enhance the anti-tumor activity in vitro of PTEN protein to Eca109 cells,its mechanism may be associated with the down-regulation of p-Akt expression level.

esophageal neoplasms;neoplasm proteins；recombinant fusion proteins；transfection；peptides;PTEN;VP22;gene therapy

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.007

四川省科技廳資助項目(2009JY0122)。 作者簡介：李婷婷(1990-)，助教，碩士，主要從事生物技術藥物藥理學方面研究。△

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1671-8348(2017)03-0308-04

2016-07-13

2016-10-04)