小半夏加茯苓醇提物對HepG2、BGC823線粒體凋亡途徑的影響*

賈亞玲，何前松，馮 泳，閆文娟，陳麗麗，羅俊剛

(1.貴州省銅仁市萬山區人民醫院中醫科 554200；2.貴陽中醫學院第二附屬醫院神經內科，貴陽 550002；3.貴陽中醫學院藥學院，貴陽 550002)

論著·基礎研究

小半夏加茯苓醇提物對HepG2、BGC823線粒體凋亡途徑的影響*

賈亞玲1，何前松2，馮 泳3△，閆文娟3，陳麗麗3，羅俊剛1

(1.貴州省銅仁市萬山區人民醫院中醫科 554200；2.貴陽中醫學院第二附屬醫院神經內科，貴陽 550002；3.貴陽中醫學院藥學院，貴陽 550002)

目的 探討小半夏加茯苓醇提物對人肝癌細胞HepG2和人胃腺癌細胞BGC823增殖抑制作用及線粒體凋亡途徑的影響。方法 運用CCK-8法檢測HepG2、BGC823的增殖抑制情況，計算生長抑制率及半數抑制濃度；運用流式細胞術和實時熒光定量PCR檢測HepG2、BGC823的線粒體跨膜電位和bax、cjun基因的表達情況。結果 小半夏加茯苓醇提物對HepG2、BGC823均有顯著的抑制作用(P<0.01)，其半數抑制濃度分別為(781.50±13.00)μg/mL和(560.05±10.06)μg/mL；與空白對照組比，試驗組HepG2的熒光強度升高(P<0.05)，試驗組BGC823的熒光強度顯著升高(P<0.01)；HepG2、BGC823試驗組的bax、cjun基因的相對表達量與空白對照組比較，均顯著升高(P<0.01)。結論 小半夏加茯苓醇提物誘導HepG2、BGC823凋亡的機制可能與激活線粒體途徑有關。

半夏屬；茯苓；肝腫瘤；胃腫瘤；小半夏加茯苓醇提物；肝癌細胞HepG2；胃腺癌細胞BGC823；線粒體凋亡途徑

腫瘤是在多因素協同作用下發生的一種細胞分化異常，呈過度生長，并以遺傳性方式產生子代細胞的新生物。雖然腫瘤的傳統治療手段具有一定的臨床療效，但是腫瘤的耐藥性和高復發率及放化療的不良反應仍是攻克腫瘤的重要障礙。因此，有學者提出中西醫聯合的腫瘤綜合治療方案。中醫學認為，痰濕是腫瘤的致病因素之一。痰濕凝聚不除，久之阻礙氣血運行而凝聚成塊，形成腫瘤。因此，化痰祛濕法為腫瘤治療的一種有效治法。小半夏加茯苓湯為中醫經典燥濕化痰、降逆止嘔的名方，本試驗結合現代分子生物檢測技術，探討該復方誘導腫瘤細胞凋亡的線粒體機制，為臨床應用該復方提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 小半夏加茯苓醇提物，50%乙醇，DMEM高糖培養基，胎牛血清，胰蛋白酶，雙抗，磷酸鹽緩沖液，CCK-8，羅丹明123，TRNzol總RNA提取試劑，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBRTMPremix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus)ROX plus，DL2000 DNA標記物、引物。

1.1.2 實驗儀器 CO2培養箱(美國熱電公司，USA31311)，超凈工作臺(上海博迅實業有限公司醫療設備，SW-CJ-2FD)，離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，L600)，顯微鏡(Nicon，TS-100F)，細胞計數儀(上海拜力生物科技公司，BIO-RAD)，水浴鍋(常州普天儀器制造有限公司金壇市晶玻實驗儀器廠，LKTC-B1)，冰箱(上海上菱百富勤，BCD-219)，超低溫冰箱(Haier，DW-86L386)，酶標儀(BioTek，EIx808IU)，流式細胞儀(BD，FACSAria)，渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，QL-902)，分光光度計(Therno scientific，NANODROP 2000)，熒光定量PCR儀(Applied Biosystems，ABI7500)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小半夏加茯苓醇提物的制備 參考前期試驗提取流程，取生半夏18 g，茯苓9 g，另將生姜切碎，稱取15 g，置于500 mL圓底燒瓶中，加入8倍量的50%乙醇于85 ℃水浴鍋中提取，溶劑沸騰開始計時，提取2 h，過濾；殘渣再加入8倍量50%乙醇，同條件提取，過濾，合并兩次濾液，搖勻，干燥，備用[1]。

1.2.2 細胞培養 人肝癌細胞(HepG2)購自上海細胞庫，人胃腺癌細胞(BGC823)購自協和細胞庫，采用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清)貼壁培養HepG2、BGC823于含CO2、37 ℃飽和濕度的恒溫培養箱內。

1.2.3 腫瘤細胞增殖抑制檢測 根據有效濃度范圍，設置HepG2的用藥濃度分別為900、800、700、600、500 μg/mL，BGC823的用藥濃度分別為800、700、600、500、400 μg/mL；取對數生長期的細胞，按照7×104/mL的密度接種于96孔板中；待細胞貼壁后，將不同濃度的醇提物加入96孔板，每組設至少3個平行孔；藥物干預24 h后，加入CCK-8；孵育1～4 h后，在酶聯免疫監測儀上測定各孔吸光度(A)值，計算抑制率和半數抑制濃度(IC50)。IC50用SPSS16.0統計軟件進行計算。計算公式：生長抑制率=(1-A試驗組/A對照組)×100%。

1.2.4 腫瘤細胞線粒體跨膜電位檢測 將細胞分為空白對照組和試驗組，根據IC50值設試驗組為終濃度800 μg/mL的醇提物溶液，空白對照組加入與試驗組等量的50%乙醇；取對數生長期的細胞接種于6孔板中；待細胞貼壁后，分別加入空白對照組和試驗組的藥液；藥物干預24 h后，加入羅丹明123進行染色，孵育10～30 min后，上流式細胞儀檢測，每份樣品檢測細胞數量1×104,測定門控內相對熒光強度。

1.2.5 腫瘤細胞bax、cjun基因表達檢測 將細胞分為空白對照組和試驗組，根據IC50值設試驗組為終濃度800 μg/mL的醇提物溶液，空白對照組加入與試驗組等量的50%乙醇；取對數生長期的細胞接種于6孔板中；待細胞貼壁后，分別加入空白對照組和試驗組的藥液；藥物干預48 h后，參照TRNzol總RNA提取試劑盒說明書和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒說明書提取腫瘤細胞RNA，并將提取的RNA逆轉錄成cDNA；參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus),ROX plus說明書，分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增，采用2-△△CT法進行數據的相對定量分析。擴增程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，45個循環。引物序列見表1。

2 結 果

2.1 小半夏加茯苓醇提物對腫瘤細胞形態的影響 倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞的生長狀態，發現空白對照組細胞形態飽滿，邊界清晰，細胞質豐富，胞核呈圓形或橢圓形；小半夏加茯苓醇提物干預細胞后，形態發生改變，細胞外形不規則，邊界模糊，并出現很多懸浮的圓形透亮細胞，見圖1、2。

表1 引物序列

A:空白對照組；B：試驗組。

圖1 兩組人肝癌細胞HepG2細胞形態(×400)

A:空白對照組；B：試驗組。

圖2 兩組人胃腺癌細胞BGC823細胞形態(×400)

2.2 小半夏加茯苓醇提物對腫瘤細胞的抑制率和IC50值 試驗結果表明，不同濃度的小半夏加茯苓醇提物對HepG2、BGC823均有顯著的抑制作用(P<0.01)；隨著醇提物濃度的減小，抑制率逐次降低(P<0.01)。小半夏加茯苓醇提物作用于HepG2、BGC823的IC50分別為(781.50±13.00)μg/mL和(560.05±10.06)μg/mL，兩種細胞的IC50差異有統計學意義(P<0.01)，見表2、圖3。

圖3 小半夏加茯苓醇提物對HepG2、BGC823的抑制作用表2 小半夏加茯苓醇提物對腫瘤細胞的抑制作用±s)

醇提物濃度(μg/mL)抑制率(%)HepG2BGC823IC50(μg/mL)HepG2BGC82390068．79±3．09a781．50±13．00a560．05±10．0680050．78±0．33a71．86±0．9170032．54±0．72a57．66±1．2860025．42±1．10a50．81±0．9550017．31±0．91a44．12±0．4340035．31±0．93b

a：P<0.01，與BGC823比較。

表3 小半夏加茯苓醇提物對腫瘤細胞熒光強度、bax、cjun的影響±s)

a：P<0.05，與空白對照組比較。

2.3 小半夏加茯苓醇提物對腫瘤細胞線粒體跨膜電位的影響 結果顯示，與空白對照組相比，試驗組HepG2的熒光強度升高(P<0.05)，試驗組BGC823的熒光強度顯著升高(P<0.01),見表3。

2.4 小半夏加茯苓醇提物對腫瘤細胞凋亡相關基因的影響 檢測發現，與空白對照組相比，HepG2、BGC823試驗組bax、cjun基因的相對表達量均顯著升高(P<0.01)，見表3。

3 討 論

目前大多數人認為，腫瘤的發生是細胞增殖失控和(或)凋亡受阻的結果。細胞凋亡又稱細胞程序性死亡，是指機體為了維持細胞內環境穩定，而由基因控制的一種細胞自主性死亡。它既是機體組織和器官發育的維護者，又是機體防御致病因素危害作用的監護者。近年來，隨著細胞和分子生物學的飛速發展，人們日益認識到程序性細胞死亡可直接影響到腫瘤治療的有效性。線粒體介導的凋亡途徑是細胞凋亡的主要途徑之一。凋亡信號可通過激活多條上游通路而作用于線粒體，線粒體將凋亡信息整合后，發生形態或功能的改變，導致線粒體膜間隙的促凋亡因子釋放，活化半胱天冬酶(Caspase)家族，促使細胞進入不可逆的凋亡程序之中。

本試驗檢測的指標包括線粒體跨膜電位(MMP)、bax和cjun基因。MMP是由線粒體的內膜與外膜的特點決定，低通透性的內膜依靠質子泵將基質中的質子泵入外室，導致線粒體膜間隙呈現正電荷，基質為負電荷，從而形成外正內負的MMP；MMP降低甚至消失，引起線粒體的呼吸鏈發生斷裂，膜間隙的促凋亡因子釋放，從而啟動細胞凋亡過程。可以說，MMP的降低是細胞凋亡的早期反應。bax是Bcl-2基因家族中的促凋亡成員，它從線粒體中釋放后，會與高同源性的bak發生寡聚化而插入線粒體外膜，引起MMP降低，啟動細胞凋亡過程；bax/bak還可通過開放線粒體通透性轉運孔使小分子物質大量涌入線粒體內，引起線粒體形態膨脹，甚至撐破外膜，導致促凋亡因子進一步釋放[2-4]；同時bax還可以與Bcl-2結合，形成異源二聚體，抑制Bcl-2的抗凋亡作用[5]。另有研究發現，凋亡早期存在線粒體從網管狀向點狀表型的轉換，并且bax基因的高表達可以加速這種轉換[6]。cjun屬于即早反應基因，它能夠對細胞內外的各種刺激和DNA損傷做出反應,且參與調控胞內轉錄因子的生物作用[7]；cjun與cfos可形成異源二聚體jun-fos，又稱AP-1，AP-1作為轉錄激活因子，可以通過調控bax而引起線粒體膜通透性的改變，釋放線粒體膜間隙促凋亡因子，最終導致細胞凋亡[8]。

小半夏加茯苓湯源自《金匱要略痰飲咳嗽病脈證并治十二》，是一首化痰降逆、和胃止嘔的名方。該方以“病痰飲者，當以溫藥和之”為制方原則，選用辛溫性燥之半夏為君，燥濕化痰，和胃降逆；配以辛溫之生姜為臣，既增強半夏之功，又制半夏之毒；茯苓淡滲利濕，寧心健脾，使水去脾健則痰飲無以由生，為佐使。三藥相合，標本兼顧，燥濕降逆祛已生之痰，健脾祛濕杜生痰之源[9]。現代研究表明，小半夏加茯苓湯及組成該復方的各單味藥均有抑制腫瘤增殖的作用[10-12]。

本試驗發現，小半夏加茯苓醇提物有抑制HepG2、BGC823增殖，并激活線粒體凋亡途徑的作用，其機制可能為小半夏加茯苓醇提物增強了腫瘤細胞中cjun和bax基因的表達，使bax與bak發生寡聚化，導致MMP降低，激活線粒體途徑，誘導腫瘤細胞凋亡。通過對比分析兩種腫瘤細胞的數據，本試驗發現，小半夏加茯苓醇提物對BGC823的抑制效應高于HepG2，與該復方長于調節胃腑升降功能相一致，其作用于BGC823的抑瘤機制有待進一步研究。

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Impacts of small Banxia plus fuling ethanol extract on mitochondrial apoptotic pathway of HepG2 and BGC823*

JiaYaling1,HeQiansong2,FengYong3△,YanWenjuan3,ChenLili3,LuoJungang1

(1.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,WanshanDistrictPeople′sHospital,Tongren,Guizhou554200,China;2.DepartmentofNeurology,SecondAffiliatedHospitalofGuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550002,China;3.CollegeofPharmacy,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang,Guizhou550002,China)

Objective To investigate the inhibition effect of small Banxia plus Fuling ethanol extract on proliferation of human liver cancer cells HepG2 and human gastric cancer cells BGC823 and its influence on mitochondrial apoptotic pathway.Methods CCK-8 was used to test the growth inhibition of HepG2 and BGC823.The growth inhibition rate and the half inhibitory concentration(IC50) of HepG2 and BGC823 were calculated;the flow cytometry and real-time fluorescence quantitative PCR were adopted to detect the mitochondrial transmembrane potential and the expression of cjun and bax genes of HepG2 and BGC823.Results HepG2 and BGC823 are significantly inhibited by small Banxia plus fuling ethanol extract (P<0.01),IC50was (781.50±13.00)μg/mL and (560.05±10.06)μg/mL respectively.Compared with the blank control group,the fluorescence intensity of HepG2 in the experimental group was increased (P<0.05),and which of BGC823 was increased more obviously(P<0.01)；compared with those of the blank control group,the bax and cjun genes relative expressions in experimental group of HepG2 and BGC823 were significantly increased (P<0.01).Conclusion The mechanism of small Banxia plus Fuling ethanol extract inducing HepG2 and BGC823 apoptosis may be related to activate the mitochondrial pathway.

pinellia;poria cocos;liver neoplasms;stomach neoplasms;small banxia plus fuling ethanol extract;human hepatocellular carcinoma cell HepG2;human gastric cancer cell BGC823;mitochondrial apoptosis pathway

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.003

國家自然科學基金項目(81160425/H2705)；貴陽中醫學院研究生教育創新項目(ZYY14034)。 作者簡介：賈亞玲(1988-)，住院醫師，碩士，主要從事方劑配伍規律與作用機制方面研究。△

R289.5

A

1671-8348(2017)03-0296-03

2016-07-11

2016-09-26)