Nrf2/ARE通路與PI3K/AKT通路相互作用對胰島細胞半胱天冬酶-3表達的影響*

李 程，夏紀毅，萬 沁

(1.西南醫科大學附屬醫院內分泌科，四川瀘州 646000；2.重慶市榮昌區人民醫院內分泌科 402460；3.西南醫科大學藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州 646000)

論著·基礎研究

Nrf2/ARE通路與PI3K/AKT通路相互作用對胰島細胞半胱天冬酶-3表達的影響*

李 程1,2，夏紀毅3，萬 沁1△

(1.西南醫科大學附屬醫院內分泌科，四川瀘州 646000；2.重慶市榮昌區人民醫院內分泌科 402460；3.西南醫科大學藥物與功能性食品研究中心，四川瀘州 646000)

目的 探討核因子相關因子2(Nrf2)/抗氧化反應元件(ARE)通路與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路相互作用對2型糖尿病(T2DM)大鼠胰島細胞凋亡和半胱天冬酶-3(Caspase-3)蛋白表達的影響及其可能機制。方法 將60只雄性Wistar大鼠分為正常對照組(NC組，n=20)、糖尿病模型組(DM組，n=20)和叔丁基對苯二酚干預組(tBHQ組，n=20)，干預8周后處死所有大鼠，TUNEL檢測胰島細胞凋亡，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定血清及胰腺組織中丙二醛(MDA)水平，Western blot檢測AKT、p-AKT、總Nrf2、核Nrf2、血紅素氧合酶1(HO-1)、Caspase-3在胰島細胞中蛋白表達水平。結果 與NC組比較，DM組胰島細胞凋亡率顯著增加(P=0.000)，而tBHQ組胰島細胞凋亡率明顯低于DM組(P=0.000)。DM組血清及胰腺組織中MDA水平較NC組明顯升高(P=0.000)，而tBHQ組血清及胰腺組織中MDA水平明顯低于DM組(P=0.000)。DM組p-AKT、總Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表達水平均較NC組顯著降低(P=0.000)，Caspase-3蛋白表達水平較NC組明顯升高(P=0.000)；與DM組比較，tBHQ組p-AKT、總Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表達水平均明顯增加(P=0.000)，Caspase-3蛋白表達水平明顯降低(P=0.017)；AKT蛋白表達水平在3組間差異無統計學意義(P>0.05)。結論 Nrf2/ARE通路與PI3K/AKT通路相互作用對抑制胰島細胞Caspase-3的表達及延緩胰島細胞凋亡進程產生重要的保護作用。

半胱天冬酶-3；糖尿病，2型；胰島；細胞凋亡；Nrf2/ARE通路；PI3K/AKT通路；氧化性應激

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(serine/threonine protein kinase,AKT)通路已被證明在調控胰島細胞凋亡方面發揮著重要作用。Li等[1]研究發現，人胰島淀粉樣多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)聚集可導致2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)胰島B細胞損傷、凋亡，這與氧化應激對PI3K/AKT通路的抑制作用不斷增強，進而激活重組人半胱天冬酶-3、8、9(Caspase-3,8,9)有關。PI3K/AKT通路調控的其中一個下游信號蛋白為核因子相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)，通過激活Nrf2，使Nrf2/抗氧化反應元件(antioxidant responsive element,ARE)通路誘導血紅素氧合酶1(hemeoxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)等抗氧化酶的表達，發揮抗氧化應激作用，而應用PI3K/AKT通路特異性抑制劑處理后，則可抑制Nrf2活性[2-3]。本研究通過激活Nrf2/ARE通路，觀察對T2DM大鼠PI3K/AKT通路、Caspase-3蛋白表達及胰島細胞凋亡的影響，以探討Nrf2/ARE通路與PI3K/AKT通路相互作用對T2DM大鼠胰島細胞的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康8周齡雄性Wistar大鼠，體質量180～200 g，由重慶騰鑫比爾實驗動物銷售公司提供。鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自美國Sigma公司；叔丁基對苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)購自比利時Acros公司；丙二醛(malondialdehyde,MDA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國Omega公司；TUNEL試劑盒購自德國Roche公司；總蛋白、核蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗大鼠AKT單克隆抗體購自美國CST公司；兔抗大鼠p-AKT(Ser473)多克隆抗體購自美國CST公司；兔抗大鼠HO-1多克隆抗體購自美國Bioworld公司；兔抗大鼠Caspase-3單克隆抗體購自美國CST公司；兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購自美國CST公司，辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立及分組 取60只雄性Wistar大鼠予以高糖、高脂飼料喂養，高糖、高脂飼料配方為普通飼料66.5%，蔗糖20.0%，豬油10.0%，膽固醇2.5%，膽酸鹽1.0%[4]。喂養4周后，空腹8 h，一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg BW(用前以pH 4.3的0.1 mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液配成1.0%的濃度)，高糖、高脂飼料繼續喂養72 h后，空腹測尾靜脈血糖大于或等于16.7 mmol/L為T2DM模型建立成功，共43只大鼠造模成功，采用隨機數字表法將其分為兩組：糖尿病模型組(DM組)20只，不用藥物干預，在高糖、高脂飼料中添加1.0%面粉；tBHQ干預組(tBHQ組)20只，參照文獻[5]的方法，在高糖、高脂飼料中添加1.0%tBHQ，余下的3只T2DM大鼠剔除。同時，另取20只Wistar大鼠作為正常對照組(NC組)，不用藥物干預，在普通飼料中添加1.0%面粉。3組大鼠連續干預8周后處死，穿刺心臟收集全血并離心，取血清放入-20 ℃冰箱凍存待測，收集胰腺組織，放入-80 ℃冰箱凍存備檢。

1.2.2 胰島細胞凋亡觀察及細胞凋亡率計算 各組胰腺組織切片采用TUNEL法檢測，操作嚴格按照TUNEL試劑盒說明書進行。在200倍光鏡下觀察凋亡細胞核(棕黃色)和未發生凋亡的細胞核(藍色)。每張切片至少選取3～5個胰島在高倍視野(×400)下計算胰島細胞凋亡率，凋亡率=凋亡細胞核數/總細胞核數×100%。

1.2.3 MDA檢測 采用ELISA法檢測血清及胰腺組織中MDA水平，測定方法按照MDA ELISA試劑盒使用說明，取大鼠胰島數目含量最多的胰尾組織約100 mg，加入RIPA裂解緩沖液，12 000 r/min低溫離心10 min，在酶標包被板上分別設標準品孔、空白對照孔、待測樣品孔。將50 μL標準品加入標準品孔中，先后將10 μL和40 μL待測樣品稀釋液加到待測樣品孔中，空白對照孔不加任何液體。然后加入抗體工作液和酶標抗體工作液繼續反應，最后加入底物工作液反應后在450 nm波長處對每孔的光密度(OD)值進行測量，根據標準品的濃度和OD值算出MDA濃度。

1.2.4 Western blot檢測目的蛋白 取大鼠胰島數目含量最多的胰尾組織約100 mg，加入RIPA裂解緩沖液，12 000 r/min低溫離心10 min，取上清液即得胰腺組織總蛋白，胰腺組織核蛋白的提取嚴格按照凱基生物核蛋白提取試劑盒說明書操作。用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，取等量蛋白電泳并轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，室溫下封閉后，滴加AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、Nrf2(1∶800)、HO-1(1∶500)、Caspase-3(1∶1 000)一抗溶液，以及標準內參GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜后加入HRP-山羊抗兔IgG二抗溶液，室溫孵育1 h，電化學發光(ECL)顯色，Bio-Rad凝膠成像系統成像，Quantity-One測灰度值并分析。實驗重復4次，取平均值。

2 結 果

2.1 各組大鼠胰島細胞凋亡率的比較 凋亡細胞縮小，細胞核染色質濃縮、碎裂。DM組胰島細胞凋亡率[(26.42±6.93)%]較NC組[(7.05±2.81)%]顯著增加(P=0.000)，tBHQ組胰島細胞凋亡率[(13.62±3.77)%]較DM組明顯減少(P=0.000)，見圖1。

A:NC組；B：DM組；C：tBHQ組。

圖1 各組大鼠胰島細胞凋亡觀察(TUNEL，×200)

2.2 各組大鼠血清及胰腺組織中MDA水平的比較 DM組血清及胰腺組織中MDA水平較NC組明顯升高(P=0.000)，tBHQ組血清及胰腺組織中MDA水平較DM組明顯降低(P=0.000)，見表1。

表1 各組大鼠血清及胰腺組織中MDA水平 比較

a：P<0.01，與NC組比較；b：P<0.01，與DM組比較。

2.3 各組大鼠胰腺組織AKT、p-AKT、總Nrf2、核Nrf2、HO-1和Caspase-3蛋白表達的比較 Western blot結果顯示：DM組p-AKT、總Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表達水平均較NC組顯著降低(P=0.000)，Caspase-3蛋白表達水平較NC組明顯升高(P=0.000)；與DM組比較，tBHQ組p-AKT、總Nrf2、核Nrf2及HO-1蛋白的表達水平均明顯增加(P=0.000)，Caspase-3蛋白表達水平明顯降低(P=0.017)；AKT蛋白表達水平在3組間差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2、表2。

圖2 各組大鼠胰腺組織AKT、p-AKT、總Nrf2、 核Nrf2、HO-1、Caspase-3蛋白表達表2 各組大鼠胰腺組織各蛋白表達的相對強度比較±s)

組別nAKTp?AKT總Nrf2核Nrf2HO?1Caspase?3NC組40．99±0．081．36±0．221．12±0．141．01±0．090．89±0．070．54±0．04DM組40．99±0．090．50±0．04a0．58±0．05a0．48±0．07a0．58±0．05a1．32±0．21atBHQ組41．02±0．131．03±0．11b1．31±0．20b1．52±0．25b1．54±0．27b1．03±0．15bF1．23942．85836．40951．41659．63448．195P0．3350．0000．0000．0000．0000．000

a：P<0.01，與NC組比較；b：P<0.01，與DM組比較。

3 討 論

PI3K/AKT通路與Nrf2/ARE通路形成的PI3K/AKT-Nrf2/ARE通路在調節機體氧化應激方面發揮著重要作用[6-7]。PI3K/AKT通路在機體各組織與細胞中廣泛存在，通過抑制Caspase家族活性來調控細胞凋亡周期[8]。Caspase家族是細胞凋亡環節中的主要參與者，Caspase-3在該環節中扮演著主要角色，Caspase-3激活與過度表達均可引起細胞凋亡信號轉導級聯反應的進一步放大，最終使細胞發生凋亡[9]。

Tie等[10]通過研究氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)對內皮祖細胞(EPCs)PI3K的亞基p85及AKT的影響發現，oxLDL可使p85亞硝基化，并顯著降低p-AKT/AKT比值，進而誘導EPCs凋亡，這一改變可通過離體抗氧化治療逆轉，提示氧化應激反應可干擾PI3K/AKT通路信號轉導，導致EPCs凋亡。根據PI3K/AKT信號轉導通路特點，PI3K與AKT結合后，先后將AKT的兩個位點(Thr308和Ser473)磷酸化，從而使AKT完全活化[11-12]，在本研究中，DM組p-AKT蛋白低表達提示其未被激活或未完全活化。同時，DM組Caspase-3蛋白表達水平上調，胰島細胞凋亡率顯著增加，說明PI3K/AKT通路失活后對Caspase-3的抑制作用減弱，從而促使胰島細胞凋亡。由于PI3K/AKT通路可誘導下游靶基因Nrf2的轉錄，進而使其磷酸化入細胞核與ARE結合，并上調抗氧化酶HO-1蛋白的表達，發揮細胞保護功能，而未磷酸化入細胞核的Nrf2在細胞質中被泛素化降解[13]。因此，本研究通過檢測Nrf2、HO-1、MDA指標來反映抗氧化應激能力和胰島細胞氧化應激水平。結果顯示，DM組抗氧化應激能力明顯減弱，胰島細胞處于高氧化應激狀態，證明氧化應激可阻礙PI3K/AKT通路信號轉導，而PI3K/AKT通路活性降低可導致Nrf2激活障礙、入核減少，并促進其被泛素化降解，從而引起Nrf2總蛋白、核蛋白表達水平均降低。由此，筆者推測，Nrf2/ARE通路活性降低或激活障礙，可下調HO-1蛋白的表達水平，導致PI3K/AKT通路更容易受到氧化應激的攻擊損傷，使Caspase-3活性逐漸增強，如此循環往復，最終加速了胰島細胞凋亡進程。

由于DM組Nrf2/ARE通路處于活性降低或失活狀態，據此，本研究選用Nrf2/ARE通路特異性激活劑tBHQ對T2DM大鼠進行為期8周的干預和觀察[14]。結果發現，tBHQ組抗氧化應激能力明顯增強，胰島細胞氧化應激水平明顯降低，提示Nrf2/ARE通路被激活后，可抑制Nrf2在細胞質中被泛素化降解，增加其磷酸化入核率，進而上調抗氧化酶表達，降低胰島細胞氧化應激水平[15]。同時，tBHQ組AKT磷酸化水平增強，并伴隨著Caspase-3蛋白表達水平下調，胰島細胞凋亡率明顯降低，由此說明激活Nrf2/ARE通路可減輕氧化應激對PI3K/AKT通路的影響，進而抑制Caspase-3蛋白活性，使胰島細胞凋亡明顯減少。

綜上所述，Nrf2/ARE通路通過抗氧化應激作用，保護PI3K/AKT通路的正常信號轉導，而PI3K/AKT通路可介導Nrf2蛋白表達，發揮Nrf2/ARE通路抗氧化應激活性。兩者相互作用、相互滲透，對抑制胰島細胞Caspase-3的表達及延緩胰島細胞凋亡進程起著重要的保護作用。

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Effect of interact between Nrf2/ARE and PI3K/AKT pathways on Caspase-3 expression of islet cell*

LiCheng1,2,XiaJiyi3,WanQin1△

(1.DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.DepartmentofEndocrinology,TheRongchangDistrictPeople′sHospital,Chongqing402460,China;3.ResearchCenterforDrugandFunctionalFood,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To explore the effect and possible mechanisms of the interact between Nrf2/ARE and PI3K/AKT pathways on the islet cell apoptosis and Caspase-3 protein expression of type 2 diabetic rats.Methods Sixty male Wistar rats were randomly divided into the normal control group(NC group，n=20),diabetic model group(DM group，n=20)and tertiary-butylhydroquinone intervention group(tBHQ group，n=20).All rats were killed after eight weeks of intervention.TUNEL was used to determine islet cell apoptosis.ELISA was used to determine MDA levels in serum and pancreatic tissues,and Western blot was used to detect the protein expression levels of AKT,p-AKT,total Nrf2,nulear Nrf2,HO-1,Caspase-3 in pancreatic tissues.Results Compared with the NC group,the apoptosis rate of islet cells in the DM group was significantly increased(P=0.000).The apoptosis rate of islet cells in the tBHQ group was significantly lower than that in the DM group(P=0.000).Compared with the NC group,the MDA levels in serum and pancreatic tissue in the DM group were significantly increased(P=0.000),while the serum and pancreatic tissue levels of MDA in the tBHQ group were significantly lower than those in the DM group.The protein expression levels of p-AKT,total Nrf2,nulear Nrf2 and HO-1 in the DM group were significantly lower than those in the NC group(P=0.000),while the protein expression level of Caspase-3 was significantly higher than that in the NC group(P=0.000).The tBHQ group had significantly higher protein expressions of p-AKT,total Nrf2,nulear Nrf2 and HO-1 than the DM group(P=0.000),while the protein expression level of Caspase-3 was significantly decreased(P=0.017).AKT protein expression level had no statistically significant difference among the three groups(P>0.05).Conclusion The interact between Nrf2/ARE and PI3K/AKT pathways generates an important protective effect on inhibiting the expression of Caspase-3 in islet cell and delaying the process of islet cell apoptosis.

Caspase-3;diabetes mellitus,type 2;islets of langerhans islet;apoptosis;Nrf2/ARE pathway;PI3K/AKT pathway;oxidative stress

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.03.002

四川省教育廳科研計劃資助項目(15ZB0153)。 作者簡介：李程(1986-)，主治醫師，碩士，主要從事糖尿病及其并發癥方面研究?！?/p>

R587.1

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1671-8348(2017)03-0292-04

2016-07-18

2016-10-16)