甘草總黃酮提取部位抗驚厥作用的研究

權洪峰 ，閆欣 ，彭曉東

1.寧夏醫科大學藥學院，寧夏銀川 750004；2.銀川市第一人民醫院藥劑科，寧夏銀川 750004

天然黃酮類化合物具有廣泛的中樞作用，且作用機制涉及調節GABA能神經在內多種神經功能的介入而發揮作用[1]。甘草始載于《神農本草經》，列為上品，因其味甘甜而得名。《中國藥典》1977年版后歷版藥典均規定甘草為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草Glycyrrhiza inflata Batal.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的根及根莖。課題組前期研究結果表明，從寧夏栽培甘草中富集所得總黃酮部位（GF）可能通過多種機制改善實驗動物的慢性應激抑郁行為[2-3]。從天然產物中獲得具有抗癲癇（epilepsy）作用的活性成分而用于臨床治療由來已久,其中不乏大量的黃酮類化合物,且涉及甘草屬藥用植物中獲得的生物活性成分[4-6]。該實驗于2017年6—8月利用傳統的電驚厥及藥物致驚厥的方法，研究寧夏地區栽培甘草中獲得的甘草總黃酮提取部位的抗驚厥作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性ICR小鼠，體重為18～22 g。由寧夏醫科大學實驗動物中心提供 [SYXK （寧）2011-0001]。動物均在室溫（22±2）℃，相對濕度 50%～60%，自然光照的條件下飼養。

1.2 實驗材料與儀器

甘草總黃酮提取部位 （GF,實驗室自制，批號：20150322）。戊四氮（批號：103065百靈威化學試劑）、匹魯卡品（批號:P6503）、阿托品(國藥準字：H20045048)、地西泮（批號:120118）、苯妥英鈉（批號:H14020776）。 生理藥理多用儀由蚌埠醫學無線電二廠生產。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及實驗步驟 實驗分為對照組、GF高劑量組 （400.0 mg/kg）、中 劑 量 組 （150.0 mg/kg）、低 劑 量 組（50.0 mg/kg）及陽性藥物對照組，分別灌胃（ig）給藥 1次/d。7 d后于末次給藥后1 h實施實驗。

1.3.2 GF對正常動物自主活動的影響實驗 采用曠場實驗(open field test，OFT)對動物自主活動的評估。實驗采用自制敞箱（30 cm×30 cm×30 cm），內壁及底部涂黑，底部劃分成 9個面積相等的方格（10 cm×10cm），攝像頭垂直距敞箱 30 cm，四周避光。將小鼠放入中心格內，開始拍攝記錄6 min，統計小鼠后 4 min內水平移動格數。小鼠每次被放入固定的中央格。曠場實驗前30 min腹腔注射（ip）地西泮（4 mg/kg）為陽性對照[2-3]。

1.3.3 最大電休克驚厥試驗 依照文獻建立小鼠最大電休克驚厥模型 （maximal electroshock seizure model，MES）[7]，小鼠篩選以35～40 V/0.5 s為參數，出現后肢強直癥狀者可用于實驗。灌胃給藥1 h后，同參數實驗，以后肢強直癥狀不發生為抗MES的陽性反應。MES前 30 min腹腔注射苯妥英鈉（50 mg/kg，ip）為陽性對照。

1.3.4 戊四氮致驚厥試驗 小鼠灌胃給藥 1 h后，皮下注射戊四氮 （100 mg/kg，sc）,給藥后觀察并記錄小鼠豎尾、陣孿以及強直各項癥狀出現的潛伏期。PTZ前30 min腹腔注射地西泮（7.5 mg/kg，ip）為陽性對照[7]。

1.3.5 匹魯卡品致急性驚厥試驗 灌胃給藥 30 min后，首先皮下注射給予1 mg/kg劑量的阿托品，30 min后腹腔注射350 mg/kg劑量的匹魯卡品誘發驚厥反應，觀察 1 h內小鼠反應。依據 Racine分級進行評估[8]，即 0級（無抽搐發作）、1 級（耳、面部抽搐）、2 級（肌陣攣，但無直立位）、3級（肌陣攣，伴直立位）、4級（全身強直陣攣發作）、5級（強直陣攣發作，并失去體位控制）。并實施記錄。1 h后腹腔注射注射2.5 mg/kg劑量地西泮終止發作。

1.4 統計方法

采用GraphPad Prism繪圖軟件和SPSS 19.0統計學軟件進行數據統計分析，計量資料以表示，組間比較采用 one-way ANOVA 的 Dunnett和 Dunnett’s T3(3)統計方法[9]。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GF對小鼠正常自主活動的影響

GF 各劑量組（400.0、150.0、50.0 mg/kg）不能影響小鼠正常自主活動（P＞0.05）。

表1 甘草總黃酮提取部位對PTZ誘導小鼠急性癲癇模型的影響[，n=15]

表1 甘草總黃酮提取部位對PTZ誘導小鼠急性癲癇模型的影響[，n=15]

注：aP＜0.05,bP＜0.01 vs對照組。

組別 劑量 行為異常潛伏期（s） 大發作潛伏期（min） 死亡時間（min） 強直數/實驗總只數（只）強直百分率（%）對照組GF 30±15 27±15 33±13 30±15 4±2（17±5）b（13±5）a 7±2 6±4（25±13）b（14±5）a 5±3地西泮400.0 mg/kg 150.0 mg/kg 50.0 mg/kg 7.5 mg/kg 15/15 7/15 10/15 15/15 1/15 100.0（46.7）b（66.7）a 100.0 6.7b

表2 甘草總黃酮提取部位對PILO誘導小鼠急性癲癇模型的影響[，n=15]

表2 甘草總黃酮提取部位對PILO誘導小鼠急性癲癇模型的影響[，n=15]

組別對照組GF地西泮劑量400.0 mg/kg 150.0 mg/kg 50.0 mg/kg 7.5 mg/kg行為異常潛伏期（s）31±4.0 28±6.0 30±11.0 32±8.0大發作潛伏期（min）4±1.0 7±1.0 6±0.6 5±0.5死亡時間（min）7±2.0 9±2.0 8±3.0 6±1.0強直數/實驗總只數（只） 強直百分率（%）15/15 12/15 14/15 15/15 1/15 100.0 80.0 93.3 100.0 7.0b

2.2 GF對鼠

小鼠 MES驚厥試驗的影響：GF各劑量組（400.0、150.0、50.0 mg/kg）不能拮抗小鼠實施最大電休克引發的驚厥，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 GF對PTZ誘導小鼠急性癲癇模型的影響

如表1所示，與對照組比較，400.0 mg/kg劑量的GF能夠顯著延長PTZ誘導小鼠癲癇大發作的潛伏期，差異有統計學意義（P＜0.01）、死亡時間，差異有統計學意義（P＜0.01）和強制發作的百分率，差異有統計學意義（P＜0.01）。150.0 mg/kg劑量的GF能夠延長PTZ誘導小鼠癲癇大發作的潛伏期，差異有統計學意義（P＜0.05）、死亡時間，差異有統計學意義（P＜0.05）和強制發作的百分率，差異有統計學意義 （P＜0.05）。而 50.0 mg/kg劑量的 GF對 PTZ誘導的癲癇發作各項參數沒有影響，差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.4 GF對PILO

誘導小鼠急性癲癇模型 的影響：如表2所示，GF各劑量組（400、150、50 mg/kg）不能拮抗 PILO 誘導小鼠急性癲癇發作，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

甘草為我國常用大宗中藥材,在中藥材中產量和銷量均居于大宗藥材的首位,同時也是食品加工、輕工業的重要原料。甘草的主要成分為黃酮類和三萜皂苷類化合物。課題組前期研究結果顯示，從寧夏栽培甘草富集得到的的GF可能通過多種機制改善實驗動物的慢性應激導致的抑郁行為[2-5]。

從天然產物中獲得具有抗癲癇作用的活性成分而用于臨床治療由來已久[4-6]，其中不乏姜黃素、木犀草素等黃酮類化合物。據報道[10]皮下注射PTZ可引起不同級別的抽搐如肌肉陣攣性抽搐、前/后肢體痙攣,最終死亡。光果甘草根水提物與空白組比較，對延長PTZ誘導小鼠癲癇發作的潛伏期以及減少陣發性驚厥持續時間無顯著作用，而光果甘草根醇提物中（200.0 mg/kg）、高劑量（400.0 mg/kg）組顯著延長了PTZ誘導小鼠癲癇發作的潛伏期并明顯減少陣發性驚厥持續時間，且與陽性藥物組（地西泮，2 mg/kg）高劑量（400.0 mg/kg）組陣發性痙攣的發作時間被推遲100%。

該實驗結果表明，在實驗劑量范圍內，GF不能影響小鼠自主活動；對小鼠PILO及MES引起的驚厥表現沒有拮抗作用。GF可以劑量依賴性的拮抗PTZ引起的小鼠驚厥。與對照組比較，400.0 mg/kg劑量的GF能夠顯著延長PTZ誘導小鼠癲癇大發作的潛伏期、死亡時間及降低強制發作的百分率（46.7%）。150.0 mg/kg劑量的GF能夠延長PTZ誘導小鼠癲癇大發作的潛伏期、死亡時間及降低強制發作的百分率（66.7%）。

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