微囊化轉VEGF基因成肌細胞在全厚皮片移植中的動物實驗研究

高崧瀛 ，孫健 ，黃巍 ，王鑫 ,李冰 ，單靜 ,孫洋 ，王鋒 ，湯維波

1.黑龍江省醫院整形頜面外科，黑龍江哈爾濱 150036；2.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院體檢中心，黑龍江哈爾濱 150001；3.黑龍江省醫院血管外科，黑龍江哈爾濱 150036;4.黑龍江省醫院手術室，黑龍江哈爾濱 150036;5.黑龍江省醫院麻醉科，黑龍江哈爾濱 150036;6.黑龍江省醫院泌尿外科，黑龍江哈爾濱 150036

CHANG在1964年首次提出人工細胞的概念，此后諸多學者在醫學領域實驗研究。目前，微囊化技術在醫學領域已廣泛應用。微囊化技術具有免疫隔離作用對細胞內的細胞，可由微囊外營養物質提供營養，同時較大顆粒的免疫成分不會對微囊內的細胞等進行吞噬及其它免疫排斥。整形外科皮膚移植是最常見的操作之一，全厚皮片具有耐磨性、顏色接近正常皮膚、彈性好，治療疤痕攣縮及面部、手部皮膚缺損等效果較為理想等多方面優點，但其較中厚、刃厚皮片成活率低，存在部分壞死風險較高不易為患者所接受，臨床應用受到限制[1-4]。

全厚皮片移植的成活，除與手術因素有關，受區的營養狀態及細胞因子的活性也有一定關系。VEGF是一種細胞因子，其對血管增殖、再生等有良好的促進作用，但VEGF在體內降解快，直接注射成本高，效果差。通過微囊化技術的免疫隔離，可使VEGF在一定時期內持續分泌，促進全厚皮片成活，由于微囊化細胞周圍纖維化、囊內氧和營養不足等原因微囊化細胞逐漸死亡，作用消失，不會對機體產生遠期未知影響。通過實驗研究，如能明顯提高全厚皮片移植的成活率，可進一步應用于臨床。因此，該研究以2016年1月購自吉林大學實驗動物中心健康Wistar大鼠50只為研究對象，對比研究微囊化轉VEGF基因成肌細胞對提高大鼠全厚皮片移植成活率的影響，為進一步的臨床應用提供理論及實踐依據。

1 材料及方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 轉VEGF基因成肌細胞 （哈醫大四院實驗中心凍存）、海藻酸鹽（Sigma公司）、氯化鋇（天津市科密歐化學試劑有限公司）、免疫組化檢測抗體（第VIII抗體）（美國DAKO公司）

1.1.2 主要儀器 DYY-5型穩壓穩流電泳儀、SHZ-88A恒溫振蕩器、全自動凝膠圖像分析系統、小型臺式離心機、TGL-16M冷凍離心機、電子天平、醫用型潔凈工作臺、恒溫培養箱、CO2孵箱、微囊發生器、倒置顯微鏡及成像系統。

1.1.3 手術器械及藥品 常規外科手術器械、敷料及巾單，1.0%戊巴比妥，75%醫用酒精，0.25%碘伏，生理鹽水。Wistar大鼠，50只，2016年1月購于吉林大學實驗動物中心，雌雄不限，清潔級。體重250～300 g。

1.2 方法

（1）將凍存的轉VEGF基因成肌細胞進行解凍、復蘇。加入有血清DMEM，放入37℃細胞培養箱中培養，并進行傳代、擴增。（2）微囊化過程將1 g海藻酸鈉加入到100 mL MilliQ水中，渦旋使部分海藻酸鹽溶解，然后將該溶液置于旋轉器上過夜。將無菌氯化鋇溶于無菌MilliQ水中，終濃度為30 mmol/L。使用前超凈臺紫外線滅菌30 min；準備好用于微囊化的C2C12成肌細胞。對于成肌細胞，先用胰酶消化，然后轉移入一50 mL falcon試管中，500 rpm離心5 min，然后棄上清。以20 mL 0.9%NaCl重懸沉淀，500 rpm離心5 min，然后棄上清。重復上述步驟。以一個連有16G套管的1 mL注射器測量細胞沉淀的體積。用套管的尖將每100 μL 1%海藻酸鹽混合均勻。安裝微囊發生器和注射器，使用前高溫滅菌。使針尖距離沉淀培養皿20 cm。調整氧氣壓力至100 kpa，調節氧氣流量為8 L/min。將海藻酸鈉/細胞懸液裝入1 mL注射器中（裝入0.8 mL）。注意不要融入氣泡。將注射器裝在微囊發生器上，打開注射器驅動器，將海藻酸鈉/細胞懸液推入到微囊發生器中。用還有30 mL BaCl2的培養皿盛接微囊，放置2 min。收集微囊到含有20 mL生理鹽水的50 mL falcon試管中。500rpm離心3 min，棄上清。重復2遍。以含有DMEM的培養瓶懸浮微囊化細胞，在37℃/5%CO2孵箱中培養。（3）大鼠全厚皮片動物模型的構建 以雙側髂棘連線為起始處，以背部中線為長軸標記為4.0 cm×4.0 cm的范圍，作為皮片移植區。動物采用清潔級Wistar大鼠，重量250～300 g，雌雄不限。2016年1月購自吉林大學實驗動物中心，實驗動物在標準動物房內飼養，標準飲食。（4）實驗動物分組 實驗動物總計50只，隨機化將其分為微囊化組和對照組。微囊化組按標記范圍切取制備全厚皮片，在切取皮片后的創面上，給予多點注射轉VEGF基因成肌細胞混懸液，每點0.1 mL，縱橫間隔呈點陣樣，間隔均為1.0 cm。然后將切取的全厚皮片原位回植，打包包扎，放回籠中單籠飼養。對照組給予相應位置等量生理鹽水注射，其他操作及步驟與微囊化組相同。（5）觀察指標 ①植皮成活面積觀察：植皮操作14 d后給予拆除打包包扎，觀察植皮成活情況，并攝影記錄。②大鼠植皮組織局部外源性VEGF檢測：取1 g大鼠移植皮膚，提取VEGF總蛋白。因該實驗所用的成肌細胞已轉染攜帶6his-tag，故通過鎳柱純化得到外源性VEGF蛋白，進行Western blot特異性目的蛋白檢測（western blot所用抗體由美國Pierce公司提供，操作方法按說明書進行），PVDF膜洗滌顯色后，固定，晾干。應用掃描儀掃描得到結果。③單位面積血管計數：在微囊組和對照組，各隨機選取10只大鼠，于植皮區域隨機切取0.5 cm×0.5 cm面積，10%甲醛固定，常規石蠟包埋、切片，HE染色，在10倍光鏡下計數12各視野下血管斷面數，并計算每平方厘米的微血管數。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 微囊觀察

微囊近球形，大小較均勻，微囊之間無粘連。隨機選取10個微囊，測得平均直徑（75±15）μm。包裹細胞數目較恒定，平均20個/微囊，培養24 h后，觀察數目無明顯變化。

2.2 全厚皮片移植存活結果

應用Image pro 5.0軟件對兩組植皮成活面積進行測算，然后SPSS 15.0統計學軟件進行分析，結果顯示，微囊化組成活面積（14.1±0.61）cm2，對照組成活面積（13.5±0.55）cm2，微囊化組成活面積百分比（88.0±3.6）%，對照組成活面積百分比（84.5±3.5）%。微囊化組植皮成活面積百分比明顯高于對照組，兩組間差異有統計學意義（t=3.42，P＜0.01），見表 1。

表1 兩組中成活面積及百分比比較

表1 兩組中成活面積及百分比比較

組別 平均成活面積 （cm2） 成活面積百分比（%）微囊化組（n=25）對照組（n=25）t P 14.1±0.61 13.5±0.55 3.42＜0.01 88.0±3.6 84.5±3.5 4.65＜0.01

2.3 血管計數結果

微囊化組與對照組中，隨機切取的皮膚進行微血管計算比較，微囊化組較對照組的微血管計數高，差異有統計學意義（P＜0.01）。 見表 2。

表2 兩組中微血管計數比較[，cm2]

表2 兩組中微血管計數比較[，cm2]

組別平均微血管數微囊化組（n=10）對照組（n=10）t P 25.8±3.99 20.6±5.46 2.43＜0.05

2.4 外源性VEGF蛋白檢測結果

通過鎳柱純化得到pcDNA6/HisA-VEGF(外源性VEGF蛋白)表達的Western blotting結果顯示微囊化組有外源性VEGF蛋白表達，對照組沒有檢測到外源性蛋白表達。

3 討論

全厚皮片移植是整形外科較為常見的治療手段之一。它被廣泛用于各種皮膚缺損的修復，如面部各種創傷（如外傷或燒傷）、腫瘤切除后等遺留的創面，重要功能部位的皮膚缺損等。植皮作為整形外科的基本治療技術，有著非常多的優點，如操作簡單，不需要吻合血管等復雜操作，全厚皮片移植成活后耐磨性好，皮膚顏色、彈性、質地較好，不存在供區知名血管、肌肉、神經損傷等風險，且植皮可選擇隱蔽部位作為供區，不受受區皮膚條件的限制。但全厚皮片移植的存活常不理想，除與術中臨床操作有一定關系，最主要因素為全厚皮片所需營養較刃厚、薄中厚皮片多，新生的毛細血管不足，不能及時長入，影響其成活。刃厚或薄中厚皮片雖較易成活，但耐磨性、易攣縮、恢復后皮膚顏色多為花斑樣等，常不能為理想的修復方法，局部皮瓣雖能彌補刃厚或薄中厚皮片的缺點，但常存在供區皮膚量不足等情況，應用也受到限制。丁菲菲等[5]對56例患者進行面部皮膚移植治療，其中全厚皮片15例，1例成活不佳，中厚皮片38例，全部成活。丁菲菲等又對142例患者，157只手部瘢痕攣縮的患者進行皮膚移植，其中115只手采用全厚皮片移植，2只手厚中厚皮片移植，40只手中厚皮片移植，全厚皮片中5例完全成活，75例基本成活，33例成活不佳，2例完全壞死；而中厚皮片移植中2例完全成活，34例成活良好，4只基本成活。此數據表明，中厚皮片較全厚皮片更易成活。全厚皮片動物模型的報道不多，該研究采用大鼠背部構建全厚皮片移植主要因為前期曾進行大鼠缺血皮瓣的實驗研究，大鼠皮下組織疏松，切取全厚皮片操作簡單，設計4.0 cm×4.0 cm的皮瓣對大鼠來說，屬較大面積植皮，更具說服力。因沒有類似的大鼠全厚皮片移植結果作為對比，故采用對照研究，以獲得較為客觀的數據。該實驗應用微囊化組和對照組各25只大鼠，全厚皮片成活面積顯示，微囊化組成活面積高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.01），與文獻資料記載臨床觀察相符合。

VEGF作為一種內皮細胞的特異性有絲分裂原，也是一種有效的血管形成和血管通透性誘導因子。VEGF具有促進血管內皮細胞增殖和遷移、誘導毛細血管管腔形成的作用。理論上可能有促進移植組織成活的作用。VEGF、bFGF等生長因子在皮片、皮瓣移植方面應用的動物實驗研究也常見報道，但通過局部皮內或皮下注射給藥方式并不理想，因VEGF體內半衰期僅6 min，通常不及擴散就被降解消失，連續給藥會加重局部的組織損傷，所以，我們提出微囊化注射的方法，能解決上述的不足。轉VEGF基因成肌細胞能持續分泌VEGF，但在體內由于排斥反應很快被免疫系統破壞。已有實驗研究證實，微囊化與否對轉VEGF基因成肌細胞分泌VEGF蛋白過程沒有顯著影響[6]。李保國等[7]也對微囊化間充質干細胞活力檢測方法進行比較，目前已有較多手段對微囊化細胞活力進行檢測。曾進行微囊化轉VEGF基因成肌細胞治療大鼠缺血皮瓣的研究，獲得較理想的效果，對該實驗進行全厚游離皮片移植也是一個啟示和佐證[8]。該次在微囊化組及對照組中，隨機各切取了10個標本進行微血管計數檢測，結果顯示，微囊化組微血管數高于對照組，且差異有統計學意義（P＜0.05）。再一次證實了VEGF的作用。微囊化細胞由于周圍纖維細胞增生，使氧氣和營養物質供給阻斷，最終微囊化細胞壞死，這是至今仍未解決的問題[9]。目前的研究結果，人工細胞還不能達到生命體那樣自我復制、自我修復、自我進化[10]。但這些對全厚皮片移植沒有任何影響，相反地，排除了微囊化細胞持續分泌VEGF，有誘發腫瘤的潛在風險[11]，是一種較為安全的方法。

綜上所述，經該實驗證實，微囊化轉VEGF基因成肌細胞在全厚皮片移植受區創面多點注射，能顯著提高全厚皮片移植的成活率。通過進一步實驗及臨床研究，將此方法早日應用于臨床，為整形外科和燒傷科醫生提供多一種理想的選擇方法。

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[1]慕森，李仔儒，杜曉明.全厚皮片移植在面部皮膚缺損修復中的應用[J].臨床皮膚科雜志，2014,43(4):255-256.

[2]慕森，趙春燕，高成貴，等.全厚皮片移植修復皮膚缺損34例[J].中華皮膚科雜志，2015，48(6):431-432.

[3]郝永紅，許明火，高全文，等.全厚皮片移植修復手部瘢痕攣縮畸形[J].中國美容醫學，2015,24(8):14-15.

[4]孫天駿，焱福.微囊化基因工程細胞的研究進展[C].中華醫學會燒傷外科學分會2011年學術年會論文匯編,2012.

[5]丁菲菲，林源，蒙誠躍，等.手指瘢痕攣縮屈曲嚴重畸形的矯形治療[J].中華損傷與雜志,2015,10(1):30-32.

[6]高崧瀛，劉長松，黃巍.微囊化對轉VEGF基因成肌細胞血管內皮生長因子分泌的實驗研究[J].黑龍江醫學,2012,36(6):417-419.

[7]李保國，劉榮，佀國寧.微囊化間充質干細胞活力檢測方法比較[J].上海理工大學學報,2016,38(6):594-597.

[8]Weihua Chen,Daping Yang,Peng Wang，et al.Microencapsulated Myoblasts Transduced by the Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)Gene for the Ischemic Skin Flap[J].Aesthetic Plastic Surgery,2011,35(3):326-332.

[9]王貫喬，朱海，劉堯娟，等.微囊化胰島細胞移植在抗纖維增生方面的相關研究[J].實用器官移植電子雜志,2016,4(6):341-344.

[10]劉巍，李培森，李可，等.人工細胞制備的研究進展[J].天津工業大學學報,2016,35(5):11-19.

[11]李玉靈，趙華，任秀寶.VEGF及其受體與免疫抑制細胞關系的研究進展[J].山東醫藥,2016,56(17):105-107.