葡萄及其制品中真菌毒素研究進展

謝漢忠，黃玉南，李 君，龐榮麗，喬成奎，成 昕

（1中國農業科學院鄭州果樹研究所/農業部果品質量安全風險評估實驗室（鄭州），鄭州450009；2農業部農產品質量安全中心，北京100081）

葡萄及其制品中真菌毒素研究進展

謝漢忠1，黃玉南1，李 君1，龐榮麗1，喬成奎1，成 昕2

（1中國農業科學院鄭州果樹研究所/農業部果品質量安全風險評估實驗室（鄭州），鄭州450009；2農業部農產品質量安全中心，北京100081）

葡萄在生產、貯藏和加工過程中，受環境條件的影響可能受到真菌的污染，進而產生不同的真菌毒素，影響葡萄及其制品的質量安全，給人類健康帶來安全風險。有關葡萄及其制品中真菌毒素的研究，多集中在歐美等葡萄產區國家，中國在這方面研究以及相關的文獻報道還比較少。筆者系統分析了污染葡萄及其制品的真菌類型、污染條件以及產生真菌毒素的種類和含量；通過真菌毒素產生環境的介紹，提出了防治真菌毒素污染的控制手段，特別是真菌毒素分子生物學的深入研究，在區分真菌毒素種類和制定真菌毒素污染的控制技術方面可有效提供技術支撐。比較各國真菌毒素檢測方法的研究，發現中國在研究水果及其制品中真菌毒素的檢測方法、制定標準和真菌毒素在水果及其制品中的最大殘留限量標準方面都存在不足。最后，提出了中國開展真菌毒素在葡萄及其制品中的研究方向。

葡萄；葡萄制品；真菌毒素

0 引言

真菌毒素(mycotoxin)是真菌在食品、農產品或飼料中生長所產生的有毒次生代謝產物，可直接污染食品、農產品和飼料，間接污染動物產品，對人類健康構成風險，是食品安全最重要的風險因子之一。真菌毒素對人類的毒性危害有2種類型；一是損傷DNA，具有致畸、致癌和致突變等特性；二是致細胞毒性，破壞質膜（細胞膜）和細胞酶，從而危害人類的健康。葡萄的生長、運輸和貯藏等過程容易受到病原微生物污染，進而產生各種真菌毒素，加工過程也可能導致葡萄制品中產生真菌毒素，給葡萄制品的質量安全帶來隱患，有關葡萄及其制品中真菌毒素的研究，多集中在歐美等葡萄產區國家，中國在這方面的報道還比較少。筆者對真菌毒素在葡萄及其制品中的污染種類、污染條件和污染劑量等內容進行了系統分析，旨在掌握真菌毒素在葡萄及其制品中的生長環境、檢測方法等，為研究和制定真菌毒素發生及傳播的控制技術提供理論依據，確保消費者的健康安全。

1 真菌毒素及其危害

目前已發現300多種真菌毒素[1]，常見或污染較普遍的真菌毒素主要有黃曲霉毒素(aflatoxins)、赭曲霉毒 素 (ochratoxin)、展 青 霉 素 (patulin)、伏 馬 菌 素(fumonisins)、玉米赤霉烯酮(zearalenone)等。其中黃曲霉毒素是毒性最強、污染較廣、危害最大的類型，其次為赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)等。黃曲霉毒素B1在1988年被聯合國世界衛生組織機構的癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer，IARC)歸為第一類致癌物質[2]，可致肝毒性或抑制免疫系統。1993年，赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)被聯合國世界衛生組織機構的癌癥研究中心列為Group 2B類致癌物，它主要危害人類的腎臟、神經系統和免疫系統，導致慢性或急性的腎臟損害，有誘變、致畸和致癌作用[3-6]。真菌的產毒形式可以分為3種類型：一類為全天候的產毒型，這類真菌在任何條件下都可產毒，而且其產毒量差異不大，屬于這類的有玉米赤霉烯酮；一類為在熱帶或亞熱帶地區易于產毒型，屬于此類的有黃曲霉毒素；另一類為在溫帶或涼濕地區易于產毒型，屬于此類的有單端孢霉烯族毒素和赭曲霉毒素等[7]。

赭曲霉毒素是霉菌（赭曲霉、疣孢青霉菌和炭黑曲霉）次生代謝物的總稱，是霉菌在侵染谷物、葡萄等產品后產生的[8-9]。其中，赭曲霉毒素A是Vander等[10]在1965年首次從赭曲霉(Aspergillus ochraceus)中分離得到的。炭黑曲霉是近幾年發現也能產生赭曲霉毒素A(OTA)的真菌[11]，主要侵染水果，如葡萄等，出現在葡萄、葡萄干、葡萄汁中OTA主要是這類真菌產生的[12-15]。

2 真菌毒素檢測方法

真菌毒素在果品中的含量極低，因此對檢測方法的要求較高。目前真菌毒素檢測常用的前處理方法有固相萃取法(SPE)、液相萃取法(liquid-liquid extraction)、凝膠滲透色譜法(GPC)、免疫親和層析凈化法(IAC)等。主要檢測分析方法有薄層色譜法(TLC)、酶聯免疫法(ELISA)、氣相色譜法(GC)、氣相色譜串聯質譜法(GC-MS/MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)等。薄層色譜法(TLC)簡捷便利，可同時做大量樣品、成本較低，缺點是重復性差、精密度低，但與IAC等前處理手段結合也有一定的應用前景。Welke等[16]采用TLC法結合電荷耦合裝置(CCD)對蘋果汁樣品中的展青霉素(PAT)含量進行了測定；酶聯免疫法特異性強、前處理簡單，但酶穩定性差、假陽性率高、需要其他方法驗證，它只適用于多種毒素的定性篩選檢測；氣相色譜法（含氣質聯用法）需要衍生化前處理、操作繁瑣。Jiménez等[17]采用HPLC和GC方法同時對香蕉中鐮刀菌產生的單端孢霉烯族毒素等11種真菌毒素進行檢測，發現GC法僅能測定2種真菌毒素，而HPLC法均能測定，且成本低、高效靈敏。高效液相色譜法（含液質聯用技術）具有更高的選擇性和靈敏度，應用極為廣泛，是同時檢測多種真菌毒素的主要手段。Sulyok等[18]采用半定量LC-MS-MS方法，對160個水果和堅果樣品中23種真菌毒素進行了多殘留檢測；Zwickel等[19]建立的HPLC-MS/MS方法可對果蔬汁和酒中12種鏈格孢霉毒素進行同時檢測，檢出限和定量限分別為0.10～0.59、0.4～3.1 μg/L。

中國頒布了水果蔬菜中鏈格孢霉毒素(SN/T 4259)的LC-MS-MS檢測方法；食品中OTA(GB/T 23502)的HPLC檢測方法；蘋果及山楂制品中展青霉素(GB/T 5009.185、NY/650)的檢測方法，食品中黃曲霉毒素(GB/T 5009.22)的檢測方法標準等，水果中真菌毒素的檢測種類和方法相對較少。

3 葡萄及其制品中真菌類型和真菌毒素含量

3.1 葡萄及其制品中真菌類型

歐洲是葡萄酒生產和消費的大國，其葡萄酒的出口量占世界出口量的70%，因此對葡萄及其制品中真菌毒素的研究較多，國內對此研究較少。何云龍等[20]從煙臺赤霞珠葡萄中分離到了7株黑曲霉菌，其中3株為炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius)，并且產生OTA。Ponsone等[21]對阿根廷門多薩省4個葡萄園中葡萄樣品進行了研究，大部分樣品在生長的各個階段均檢測到了炭黑曲霉菌(Aspergillus niger)和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)，且晚熟品種‘勃納達’(Bonarda)和早熟品種‘坦普拉尼羅’(Tempranillo)樣品上檢測到了OTA；Rosa等[22]從阿根廷的葡萄樣品中檢測到了48份黑曲霉菌(Aspergillus niger)，其中8份產生OTA，在巴西的葡萄樣品中檢測到了53份黑曲霉菌(Aspergillus niger)，其中16份產生OTA，同時在這2個地區的葡萄酒中也檢測到了OTA。Battilani等[23]研究了意大利北部3個葡萄園和南部6個葡萄園中不同生育期葡萄被霉菌污染的情況，發現炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius)侵染著色期的葡萄，并且是產生OTA的主要霉菌。García等[24]在西班牙從葡萄果實上分離到了曲霉屬菌(Aspergillus)、鏈格孢屬菌(Alternaria)、枝孢屬菌(Cladosporium)和青霉屬菌(Penicillium)；發現黑霉菌在較熱地區發生率高于東北地區，炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius)在南方和東北地區均是主要的OTA產生菌。Abarca等[25]對西班牙市場上的葡萄干樣品（黑加侖、葡萄干和小葡萄干）進行了研究，結果顯示50份葡萄干樣品，有49份樣品被真菌污染，被污染的樣品中均檢測到了黑曲霉菌，58%的樣品中檢測到了炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius)，并且炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius)是主要產生OTA的霉菌。2001—2003年連續3年，在西班牙拉里奧哈地區，研究人員發現葡萄采收前黑曲霉菌是主要的致病菌，其中78%～100%的炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius)能夠產生OTA[26]。Logrieco等[27]在澳大利亞的研究，也印證了葡萄果實上的OTA主要是炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius)產生的，該霉菌是在葡萄著色期開始侵染葡萄果實，在葡萄果實成熟期及破損的葡萄果實上OTA含量增加。曲霉菌(Aspergillus)和青霉菌(Penicillium)經常在葡萄成熟期和曬干期間生長并產生OTA[28-29]。Fel??ciová等[30]在斯洛伐克從葡萄果實中分離到582株真菌，屬于10個屬，主要是鏈格孢屬、曲霉屬、葡萄孢屬和青霉屬。2008年7月，斯洛伐克的低溫高濕導致葡萄被真菌污染，污染葡萄的真菌主要是曲霉菌屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、單格孢屬(Ulocladium)和木霉屬(Trichoderma)，而且檢測到的毒素有OTA、伏馬菌素(fumonisins)、白僵菌素(beauvericin)等[31]。2016 年，首次報道了黑曲霉在烏拉圭Tannat葡萄上的發生情況，發現Aspergillus uvarum和Aspergillus welwitschiae是主要的真菌類型，而通常認為的OTA主要產生菌Aspergillus carbonarius未檢測到[6]。總之，不同栽培區域的葡萄，都有被真菌污染的報道，能從葡萄上分離到的真菌種類主要有曲霉、青霉、根霉、毛霉、鏈格孢屬、鐮刀菌和枝孢屬等，且表面破損葡萄上的污染量高于健康葡萄，在各地污染的葡萄中均發現有黑曲霉菌，而且大部分能產生OTA[32]。

3.2 葡萄及其制品中真菌毒素含量

由于真菌毒素污染食品對人類健康構成威脅，人們對真菌毒素的研究越來越廣，葡萄及其制品中真菌毒素的研究也越來越深。Abrunhosa等[3]以釀酒葡萄主栽品種‘赤霞珠’為材料進行了研究，在被污染的葡萄中測定OTA含量，果肉中OTA含量為0.58～0.86 μg/kg，葡萄皮中OTA含量為200.68～307.88 μg/kg，含量差別極大。Zhang等[33]對國內不同地區釀造的119種葡萄酒（包括干酒、冰酒）進行取樣檢測，結果顯示OTA含量值為 0.1～5.65 μg/L，且東北部地區 OTA 檢出值較高，平均含量為2.18 μg/L。Sage等[34]在法國的研究發現，11份葡萄汁樣品中有8份檢測到炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius)產 生的 OTA，含 量為 10～461 ng/L，并且葡萄中存在的產生赭曲霉毒素的菌株與葡萄汁中OTA密切相關。Ponsone等[21]研究了阿根廷的葡萄、葡萄干、葡萄汁被污染情況，發現阿根廷門多薩省4個葡萄園在被真菌污染的晚熟葡萄品種‘勃納達’(Bonarda)和早熟品種‘坦普拉尼羅’(Tempranillo)果實中檢出了OTA，含量水平在1.3～50 μg/L，紅葡萄汁中OTA含量較低，平均值分別為0.12 μg/L，60%的葡萄干樣品中檢測到了OTA，含量0.26～20.28 μg/kg。Stefanaki等[35]在 2003 年報道了希臘葡萄及其制品中OTA的檢測情況，在1998—2000年間收集的自制葡萄干中，54份黑加侖的OTA含量中值為1.3 μg/kg，而27份無核小葡萄干中OTA含量中值為0.6 μg/kg。摩洛哥的研究人員發現，從零售店和當地超市購買的20份葡萄干樣品中，黃曲霉毒素B1發生率為20%，含量3.2～13.9 μg/kg，平均含量10.7 μg/kg，最高含量13.9 μg/kg；20份葡萄干樣品中，30%檢測到了OTA，含量0.05～4.95 μg/kg，但含量未超過歐盟對此的規定[36-37]。Aksoy等1999—2003年間，在土耳其收集了1885份葡萄干樣品，所有樣品中僅0.6%的樣品OTA含量超過10 μg/kg，9.3%的樣品未檢測到OTA，其余樣品OTA含量0.3～10 μg/kg，總體平均含量(1.36±2.91)μg/kg[38]。Serra等[39]建立了釀酒用葡萄中OTA的檢測方法，并運用此方法檢測葡萄牙4個產區的11個葡萄園中11份葡萄樣品，其中3份樣品檢出OTA，含量為0.035～0.061 μg/kg。《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2011)標準，規定了展青霉素在水果及其制品中（僅限蘋果、山楂原料制成的產品）、飲料類、酒類的最大殘留限量為50 μg/kg，其他真菌毒素在水果（葡萄）及其制品中的限量尚未規定。歐盟規定葡萄干中OTA最大殘留限量值為10 μg/kg，葡萄酒和葡萄汁中OTA最大殘留限量值為2 μg/kg[40]；加拿大規定OTA在葡萄干和葡萄汁中的最大殘留限量值和歐盟一致；保加利亞規定OTA在葡萄汁中的最大殘留限量值為3 μg/kg[41]。受各地環境因素的影響，葡萄及其制品中真菌毒素含量不一。但真菌毒素超限量的情況各地都存在，葡萄皮中的OTA含量遠高于果肉中的含量，而葡萄汁或葡萄酒中的OTA含量相對較低。

4 真菌毒素分子生物學

2006年，Selma等[42]首次使用實時定量PCR方法鑒定出了發生在葡萄上炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)的DNA，而且OTA的產生與細胞色素P450有關。Khoury等[43]用特異性引物aflJ和aflR，進行聚合酶連反應(PCR)擴增，擴增產物應用內切酶BglⅡ和限制性片段長度多態性(RFLP)技術進行標記，黃曲霉(Aspergillus flavus)擴增出了362、210、102 bp 3個特異位點，寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)擴增出了363、311 bp 2個特異位點。因此，該方法可以簡單、快捷地應用在區分被侵染的葡萄果實上的這2種霉菌。Storari等[44]在意大利特倫蒂諾高山地區的葡萄樣品上分離到了OTA，進一步研究發現產生OTA的是黑曲霉菌(Aspergillus niger)和炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius)，并發現了OTA合成的重要基因是An15g07920。Somma等[45]研究發現，在黑曲霉(Aspergillus niger)中檢測到的fum8基因與伏馬菌素的合成有關，葡萄果實上的黑曲霉(Aspergillus niger)和泡盛曲霉(Aspergillus awamori)是伏馬菌素B2的產生菌。

5 真菌毒素生長環境及控制方法

5.1 真菌毒素生長環境

曲霉菌屬(Aspergillus)和青霉菌屬(Penicillium)能夠在高溫低濕環境下生長，而鐮刀菌屬(Fusarium)則在高濕低溫環境下生長；曲霉菌屬(Aspergillus)在高溫高濕條件下容易產生OTA[9,46-47]。黑曲霉侵染葡萄與溫度間呈正相關關系，與相對濕度或降水量無關[28]。炭黑曲霉菌當溫度在30℃、水分活度為0.95時，其生長速率最快，當水分活度低于0.85時停止生長，類似的情況在阿根廷、西班牙、以色列、澳大利亞和歐洲國家均有研究發現[46,48-49]。炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)最適生長和產毒溫度分別為30℃和20℃，最適生長和產毒的相對濕度為86%[50]。在葡萄干表面，赭曲霉菌的最佳生長溫度(20℃)和濕度(18%～22%)與OTA大量積累的溫度(25℃)和濕度(22%～26%)不完全重合，低溫保存(2～10℃)可減緩但不能停止OTA的產生，而干燥保存（濕度＜14%）是防止OTA產生積累的有效方法；比較清水清洗、超聲波清洗或紫外照射方法對降低葡萄干表面的赭曲霉菌和OTA，發現超聲波清洗的殺菌和降低OTA濃度效果最顯著。經過日曬干燥處理制作的葡萄干比其他方式更容易感染OTA，在陰涼干燥條件下釀造的葡萄酒OTA含量明顯高于干熱條件下釀造的葡萄酒[51]。

5.2 真菌毒素控制方法

在葡萄生長過程中，受環境因素的影響，葡萄很可能被真菌污染，被污染的果實上甚至產生多種次生代謝產物，如OTA等，當葡萄成熟后，采摘、運輸和貯藏過程可能成為OTA等毒素轉移的媒介，尤其可能導致葡萄酒中OTA含量的增加[52]。OTA在葡萄汁中的含量，受到葡萄收獲前和收獲后的環境條件、葡萄園的地理位置、葡萄品種的影響較大，在對葡萄進行破碎制造葡萄汁的過程中，葡萄果實上的OTA會進入葡萄汁[53]。葡萄采摘過程直接去除腐爛果或被真菌污染的果實，是減少果實真菌毒素風險的重要環節，但鏈格孢菌屬(Alternariaspp.)可在果實表皮無明顯變化的情況下使內部果肉污染腐爛，這種污染并不能通過人工分揀、沖洗等手段去除毒素，這給葡萄制品帶來潛在的風險。所以葡萄生長過程防治真菌毒素的發生和全過程控制真菌毒素的轉移，都是降低葡萄及其制品中真菌毒素風險的重要環節。

真菌毒素的防治主要包括除毒和抑毒，除毒主要是用物理、化學和生物學方法清除毒素或者使其失去毒性[54-55]，抑毒主要是通過作物抗病育種、化學藥物防治和生物方法抑制毒素產生[54]，而應用化學、物理和生物等方法都可以減少農產品中真菌毒素的產生，如OTA等[47,56]。使用殺蟲劑Lufox（氨基甲酸鹽類殺蟲劑）、Decis（合成除蟲菊酯殺蟲劑）和Bt（蘇云金桿菌），可以減少因蟲害而引起的葡萄破損，可有效降低葡萄酒中OTA含量，Bt也可以明顯抑制葡萄上產生OTA真菌的生長[57]。良好的耕作措施、降低破損漿果的數量、及時移除破損的葡萄等措施都是降低葡萄干中OTA含量的有效方法[58]。遲蕾等[59]研究發現，60Co-γ射線照射可以有效降解水溶液中的OTA含量，而且對低濃度OTA水溶液的降解效果最好，當輻照劑量為4 kGy時，水溶液中赭曲霉毒素A的降解率可達到90%。澳大利亞的Hocking等[60]研究發現，炭黑曲霉菌(Aspergillus carbonarius)和黑曲霉菌(Aspergillus niger)是主要的OTA產生菌，然而，通過合理的耕作、灌溉和修剪可以降低土壤中黑曲霉的水平，從而可以減少葡萄及其制品中OTA的含量；另外，避免果實的破損、快速干燥、徹底的清洗和儲藏時移除霉變的果實都可以減少OTA在葡萄產品中的含量。

6 展望

葡萄及其制品中真菌毒素的產生受環境因素、制作工藝、存儲條件等影響較大，通過系統分析發現，葡萄及其制品中真菌毒素的污染較為普遍，個別地區、某些毒素污染較為嚴重，葡萄皮中OTA含量達到307.88 μg/kg。目前，有關葡萄及其制品中真菌毒素的研究主要集中在歐美國家等葡萄產區，從筆者引用的文獻看，國外文獻占80%以上，中國在這方面的研究還有待提高。首先應研究不同區域、不同時期葡萄及其制品被真菌污染的類型、產生次生代謝物的種類和污染含量；其次是通過真菌毒素和次生代謝物產生環境條件的研究，提出更好地控制真菌毒素產生的物理、化學或“雞尾酒”試的防治方法，確保葡萄及其制品的質量安全。比較各國真菌毒素檢測方法的研究，發現中國在研究水果及其制品中真菌毒素的檢測方法、制定標準和真菌毒素在水果及其制品中的最大殘留限量標準方面都存在不足。《食品安全國家標準食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2011)只規定了展青霉素在水果及其制品中（僅限蘋果、山楂原料制成的產品）、飲料類、酒類的最大殘留限量為50 μg/kg，其他真菌毒素在水果（葡萄）及其制品中的限量尚未規定。2017年9月17日實施的新修訂標準GB 2761—2017，只增加了葡萄酒中OTA最高殘留限量為2 μg/kg，仍與葡萄及其制品中污染真菌毒素種類之多是不相稱的。而歐盟、CAC等在水果及其制品中真菌毒素的限量標準數量多于中國，加拿大規定了葡萄、葡萄干中OTA的限量標準。所以，建立真菌毒素在水果及其制品中檢測方法；深入開展真菌毒素的毒理學研究，制定其在葡萄及其制品中真菌毒素最大殘留限量標準等工作將是今后一段時間的研究方向。

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Research Progress of Mycotoxins in Grapes and Its Products

Xie Hanzhong1,Huang Yunan1,Li Jun1,Pang Rongli1,Qiao Chengkui1,Cheng Xin2
(1Zhengzhou Fruit Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Fruit(Zhengzhou),Ministry of Agriculture,Zhengzhou 450009,Henan,China;2Center for Agri-food Quality and Safety,Ministry of Agriculture,Beijing 100081,China)

Fungi are major pathogens that cause contamination during grape production,storage and transportation.Several classes of mycotoxins produced by fungi could simultaneously contaminate grape.In addition to their ability to cause spoilage of grape fruit and its related products,these mycotoxins could cause potential harm to human health.Studies of mycotoxins in grapes and its products were more concentrated in the main grape production areas such as Europe and the United States,but less in China.This paper systematically analyzed the kinds of fungus contaminating grapes and its related products,pollution conditions,mycotoxins types and pollution levels.Through the introduction of mycotoxins producing environment,it developed prevention strategies and control methods for mycotoxin contamination.With advancement of scientific research in molecular biology of mycotoxins,progress was achieved in the identification of mycotoxins and the development of techniques in controlling mycotoxins contamination.This review found that standards of the maximum residue levels and determination methods of mycotoxins in fruit and its products in China were insufficient by comparing determination methods of mycotoxins in other countries.Finally,it proposed future research direction of mycotoxins in grape and its related products in China.

Grape;Grape Products;Mycotoxins

S-3

B論文編號：cjas17050009

中國農業科學院科技創新工程項目“果品質量安全控制技術研究”(CAAS-ASTIP-2017-ZFRI-10)；國家農產品質量安全風險評估項目“果品質量安全風險隱患摸底排查與關鍵控制點評估”(GJFP2017003)。

謝漢忠，男，1965年出生，河南上蔡人，副研究員，碩士，主要從事果蔬質量安全與風險評估。通信地址：450009鄭州市航海東路南中國農業科學院鄭州果樹研究所，Tel：0371-65330935，E-mail：xiehanzhong@caas.cn。

成昕，女，1967年出生，北京人，高級經濟師，碩士，研究方向：農產品質量安全。通信地址：100081北京市海淀區學院南路59號農業部農產品質量安全中心，Tel：010-62133119，E-mail：hellen1231@126.com。

2017-05-08，

2017-06-19。