多花山竹子組培初代培養技術研究

李肇鋒，黃碧華，周俊新，余榮卓，黃華明

（1福建林業職業技術學院，福建南平353000；2福建省林業科技試驗中心，福建南靖363600）

多花山竹子組培初代培養技術研究

李肇鋒1，黃碧華2，周俊新1，余榮卓1，黃華明1

（1福建林業職業技術學院，福建南平353000；2福建省林業科技試驗中心，福建南靖363600）

旨在為多花山竹子組培快繁體系建立提供參考。通過觀察對比試驗法、完全隨機化法正交試驗設計、方差分析、顯著性檢驗、LSD多重比較，探討多花山竹子組培的外植體最佳消毒時間控制和最適初代培養基類型與激素濃度配方。試驗表明：多花山竹子組培的外植體消毒時間為2 min時其污染率最高、死亡率與存活率較低。消毒時間為6 min時其污染率和死亡率居中、存活率最高。消毒時間為10 min時其污染率與存活率最低、死亡率最高。以MS和B5作為多花山竹子組培的初代培養基培養效果較好，若對MS和B5分別添加不同濃度的6-BA和NAA，對其外植體不定芽的誘導促進作用不同，MS的最佳配比為6-BA1.6 mg/L+NAA0.9 mg/L，B5的最佳配比為6-BA1.6 mg/L+NAA0.6 mg/L。綜上，外植體消毒時間為6 min、MS+6-BA1.6 mg/L+NAA0.9 mg/L的培養效果最好。

多花山竹子；組織培養；繁殖技術；正交試驗

0 引言

多花山竹子(Garcinia multifloraChamp)為藤黃科山竹子屬，是一種常綠小喬木，又名山枯木、竹枯木、山枇杷等[1]。植株一般高5～17 m，花期4—5月，果期10—12月。花朵組成聚傘形，再排成總狀或圓錐花序，頂生，花為橙黃色；其葉片對生，革質，富有光澤，枝葉濃密，枝條著生角度小，樹體呈圓柱形，樹姿外觀緊湊優美[2]。

該樹種適應性強，在云南、四川、江西、福建、廣西等海拔2000 m以下的南嶺以南至華南、西南山區均有分布。多花山竹子喜肥沃、深厚、濕潤的酸性土壤，在天然林中居第二、三層，屬伴生樹種。人工移栽后，此樹種在水肥條件較好的環境中生長迅速，6年生胸徑可達5～6 cm、高5 m以上，并能正常開花結果。漿果為黃綠色，近球形，果實可食部分占29%～45%，其中含可溶性固形物16.8%、檸檬酸0.63%、維生素C 12 mg/100g，內含黃色膠質，略帶澀味，口感酸甜；種子中含油51.22%，可用于提煉制作肥皂和機械潤滑油及生物柴油；根、果皮及樹皮可提煉栲膠，亦可入藥，具消腫收斂、止痛之功效[3]。由于多花山竹子葉形秀麗，蔭質好，樹冠整齊，花期持續時間長，且具有抗病強、病蟲害少的生長特點，日常養護較為簡單，相較于外來樹種栽培更易成活，因而常用于行道綠化、花壇叢植、庭蔭栽植及相關園林綠化中，為優良的鄉土園林綠化觀賞樹種。

近年來，隨著林下經濟發展和城鎮綠化的推進，多花山竹子資源的開發利用程度不斷深入，山區林農把其當作油料植物和中藥材在林下加以推廣種植，作為優良的鄉土園林綠化觀賞樹種，在城鎮綠化中需求量大，當前市場上苗木供不應求。據文獻檢索，目前對多花山竹子資源開發利用的研究較多，諸如王兵等[3]、崔笛等[4]、黨澤方等[5]、張寶軍等[6]、王英強等[7]從其化學成分及藥用價值進行了研究；楊志玲等[8-9]、李秀全等[10]、祿文林等[11]、單永年等[12]對其油料及經濟價值進行了研究；文定青等[13]、劉子金等[14]對其分布和區系特征以及遺傳多樣性方面進行了研究；楊嶸[15]等對其在園林中的應用進行了研究；鄭小春等[16]、劉勝洪等[17]、李肇鋒等[18]、王英強等[19]、瞿學昌等[20]、傅家祥等[21]對其種子萌發與幼苗生長分析等播種育苗和扦插繁殖技術等方面進行了深入研究探討。從上可看出有關多花山竹子繁殖方法的研究探討雖然不少，但大多還局限于傳統的種子播種和枝條扦插繁殖方面。由于多花山竹子天然資源散生分布、種子產量少，加上受到種子采集調制和插穗枝條選取等條件的限制，傳統的播種和扦插繁殖方法育苗周期長，苗木易出現變異性，導致得到的幼苗質量良莠參差不齊，無法達到快速、標準、優質的目的，無法滿足市場優質苗木需求量大、供不應求的難題。植物組織培養作為一種無菌、高效、快速且可工廠化的新型繁殖技術，雖已在植物繁殖領域得到廣泛應用[22]，但有關多花山竹子通過組織培養快速繁育方面的研究探討還未見報道。在植物組織培養繁育中，對外植體質的消毒時間控制和初代階段培養基類型選擇與外源激素濃度配比是繁育能否成功的關鍵。本研究旨在突破多花山竹子傳統的播種和扦插繁育模式，通過試驗研究探索多花山竹子在組織培養中的外植體消毒最佳時間控制和最適宜的初代培養基類型與激素濃度配方，為多花山竹子組織培養快速繁育體系提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

為了后代能夠獲得優良的遺傳基因，并考慮到試驗材料的可獲得性，本試驗選擇播種繁殖2年生的超級苗植株為試驗材料。從福建林業技術學院江南校區林學系教學實訓基地苗圃采集多花山竹子的2年生植株健壯嫩枝條作為試驗原始材料。消毒藥劑為0%～75%酒精(C2H6O)和0.1%升汞(HgCl2)。培養基為MS、B5，激素為6-BA、NAA。

1.2 試驗材料預處理

首先，從優選出的多花山竹子2年生超級苗植株上剪取莖尖及其苗木中上部腋芽飽滿、節間較短的枝條作為外植體，去除葉片，保留葉柄，長度約10 cm。其次，用毛刷輕刷洗凈附于莖枝上的細絨毛和其他粘著物，用自來水流動沖洗1～2 h后放至接種室超凈工作臺上。然后，用70%～75%酒精(C2H6O)消毒20 s，用無菌水清洗1遍，再轉入0.1%升汞(HgCl2)溶液中[23]。

1.3 培養環境

為防止切口褐化，在接種后需要對多花山竹子進行7～10天暗光培養處理[22]。在光照培養階段，要求光照強度為2000～2500 lx，每天光照時間為10～12 h，溫度為(24±2)℃。誘導（初代）培養蔗糖用量為15 g/L，抗壞血酸5 mg/L，半胱氨酸5 mg/L，瓊脂粉7 g/L，酸堿度pH 5.9[24]。

1.4 試驗設計

1.4.1 外植體消毒時間控制試驗設計 在植物組織培養中，由于不同消毒時間會對外植體的存活率和污染率產生不同的影響[25]，消毒時間太短則會導致消毒不完全，外植體污染率升高；消毒時間太長則會降低外植體的存活率，所以探究該外植體的最佳消毒時間非常有必要。根據不同植物的組織培養繁殖的實踐操作經驗，本試驗設置了2、6、10 min這3個消毒時間，用0.1%升汞(HgCl2)消毒完后再用無菌水沖洗枝條（外植體）4～5遍。最后，將枝條（外植體）置于經過高溫消毒的濾紙上瀝干，再切割成1.0～1.5 cm長度并帶有1個腋芽的莖段。將這些莖段轉接在不加激素的MS基本培養基上，經過20天觀察統計其外植體的污染率、死亡率和存活率。試驗設計與結果如表1。

表1 HgCl2消毒時間對外植體污染率、死亡率、存活率的影響

1.4.2 初代培養基與激素配方篩選試驗設計 本次試驗共設置2個試驗組和1個對照組，采用L9(34)正交試驗設計[26]的方法探索研究多花山竹子組培初代階段的最適組培配方。試驗的各組基本培養基、激素濃度的基本情況（第2組為空白對照組）如表2。多花山竹子初代培養正交試驗設計的9種方案如表3。

表2 花山竹子初代培養正交試驗因素

表3 多花山竹子初代培養正交試驗設計表

根據正交試驗設計表，對多花山竹子實施9種初代培養試驗方案。每種試驗方案對應一種培養基類型和激素配方，將表面經過消毒的帶有側芽的莖段接種于不同的培養基上，每種試驗方案處理50瓶多花山竹子瓶苗。為排除偶然因素的干擾，循環重復操作3次。經過30天觀察分別統計不同處理方案下，多花山竹子的不定芽數和萌芽率，通過方差分析和顯著性檢驗、LSD多重比較篩選出最佳初代培養基類型與激素配方。

2 結果與分析

2.1 外植體消毒時間控制試驗結果

由表1可知，多花山竹子外植體的消毒時間控制為2 min時，其污染率最高，達63%，死亡率最低，為18%，存活率為較高，達19%；消毒時間控制為6 min時其外植體的污染率和死亡率居中、分別為42%和31%，存活率最高，達27%；消毒時間為10 min時其外植體的污染率最低，為12%，死亡率最高，達88%，存活率為0。可見外植體不同消毒時間控制的消毒效果差異較大，消毒時間太短，雖然出現死亡率最低，但其污染率最高，這可能因消毒時間太短而出現消毒滅菌不徹底；消毒時間太長，雖出現污染率最低，但其死亡率最高，存活率為0，這可能因消毒時間太長對外植體造成傷害。綜合考慮外植體的污染率、死亡率和存活率3個因素，最后確定選擇消毒時間6 min作為后續試驗中誘導多花山竹子外植體的最佳消毒時間控制。

2.2 初代培養基與激素配方篩選結果

多花山竹子初代培養正交試驗結果如表4。多花山竹子初代培養正交試驗方差分析表如表5。

從正交試驗結果表4和表5的初代培養正交試驗方差分析、顯著性檢驗、LSD多重比較可知，3個因素對多花山竹子外植物體誘導萌芽的影響大小依次為：6-BA＞NAA＞基本培養基。其中，6-BA的方差最大，為17.8982，NAA的方差為7.5448，說明6-BA對多花山竹子誘導萌芽的影響遠大于NAA。

由表4的試驗結果分析發現，當多花山竹子外植體在相同培養基培養時，不同濃度的激素對外植體的誘導促進作用表現不同，外植體所生長出的不定芽數量在高濃度的6-BA、NAA培養基和低濃度的6-BA、NAA培養基上存在著顯著差異。當6-BA、NAA的濃度相同時，外植體在不同基本培養基上生長出的不定芽數量亦存在著顯著差異。

由表4的試驗結果分析表明：在試驗3的條件下不定芽數量最多，平均有4.7個不定芽；試驗9的平均不定芽數目次之，為3.9。試驗1和試驗4誘導的不定芽數均較少，這可能是因為試驗1和試驗4中的培養基6-BA和NAA的濃度太低，使得其對植物生長的誘導促進作用不明顯。由于試驗3的不定芽數最多，所以確定該培養基配方為多花山竹子進行組織培養的最適初代培養基類型與激素配方。即在MS+6-BA(1.6 mg/L)+NAA(0.6 mg/L)的培養基配方下，多花山竹子外植體細胞分化能力較強，產生較多的不定芽。

表4 多花山竹子初代培養正交試驗結果

表5 多花山竹子初代培養正交試驗方差分析表

3 結論與討論

（1）在植物組織培養中，不同消毒時間會對外植體的存活率和污染率產生不同的影響。消毒時間太短，會出現消毒不完全或不徹底；消毒時間太長，則影響其存活率。對多花山竹子組培初代培養的外植體消毒時間為2 min時其污染率最高、死亡率與存活率較低，消毒時間為6 min時其污染率和死亡率居中、存活率最高，消毒時間為10 min時其污染率與存活率最低、死亡率最高；綜合考慮外植體的污染率、死亡率和存活率3個因素，最后確定消毒時間6 min作為后續試驗中誘導多花山竹子外植體的最佳消毒時間控制。顏敬昌[23]、朱建華等[24]研究植物組織培養外植物體的消毒時間控制6 min時，認為消毒效果最佳，與試驗研究結果相吻合。

（2）基本培養基和激素為植物組培外植物體生長誘導的主導因子。以培養基(MS、B5)和激素(6-BA、NAA)作為多花山竹子組培的初代培養基和激素培養效果良好，其對多花山竹子外植物體誘導萌芽的影響大小依次為：6-BA＞NAA＞培養基(MS、B5)。對MS和B5分別添加不同濃度的6-BA、NAA，其外植體不定芽生長的誘導促進作用不同，MS的最佳配比為6-BA 1.6 mg/L+NAA0.9 mg/L，其外植物體平均生長不定芽為4.7個；B5的最佳配比為6-BA1.6 mg/L+NAA0.6 mg/L，其外植物體平均生長不定芽為3.9個；綜合考慮各因素和激素交互作用，MS的最佳配比(6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.9 mg/L)優于B5的最佳配比（6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.6 mg/L）。譚文澄等[28]認為，MS培養基是目前使用最普遍的培養基；陳正華[29]研究用觀賞植物莖尖或苗木中上部飽滿腋芽作為外植體誘導的最適培養基為MS+6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.9 mg/L；與試驗研究結果一致。

（3）本試驗在多花山竹子組培初代培養中只對常用的培養基（MS和B5）、激素（6-BA與NAA）進行研究探討，其他基本培養基類型、激素種類等因素條件有待進一步研究分析。

（4）在組培快繁中，一般對外植體的預處理除了常用70%～75%酒精(C2H6O)消毒，用無菌水清洗，再轉入0.1%升汞(HgCl2)溶液中外，還有消毒劑如次氯酸鈉(NaClO)及其不同劑量可供選擇，其不同效果尚需要做進一步的深入研究探討。

（5）在組織培養中，由于不同消毒時間會對外植體的存活率和污染率產生不同的影響，本試驗根據多年來的組培實踐操作經驗設置了2、6、10 min等3個消毒時間，進行對比觀察，確定存活率最高達27%的消毒時間為6 min，作為后續誘導試驗的最佳消毒控制時間。至于其他不同消毒時間控制對外植體的存活率和污染率產生不同的影響，有待于進一步深入對比觀察。

由于多花山竹子資源天然分布分散，種產量少，種苗市場供不應求已成為制約其資源深度開發利用的瓶頸。本試驗突破傳統的播種與扦插繁殖模式，運用無菌、高效且可工廠化生產的植物組織培養快繁技術，首次對多花山竹子開展組織培養與快繁技術探討研究，不失為有效解決其優質種苗快速繁殖的重要途徑。試驗研究表明：多花山竹子組培初代培養的外植體最佳消毒時間控制為6 min時，其污染率為42%，死亡率為31%，存活率達27%；多花山竹子初代培養基的最適配方為：MS+6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.9 mg/L，其外植體產生不定芽數量的增殖倍數達到4倍以上。這為多花山竹子組織培養快速繁育體系提供了參考依據，填補了其組織培養與快繁技術研究的空白，有效拓展了其繁殖模式，具有重要的理論價值與現實經濟意義。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第五十卷,第二分冊,藤黃科）[M].北京:科學出版社,1990:86-89.

[2]陳有民.園林樹木學[M].北京:中國林業出版社,1990:247-251.

[3]王兵,穆淑珍,黃烈軍,等.多花山竹子化學成分的研究[J].中成藥,2010(11):39-41.

[4]崔笛,吉炳琨,黃文忠,等.多花山竹子莖葉中1個新的縮酚酸環醚化合物[J].中草藥,2017(9):48-51.

[5]黨澤方,譚紅勝,付文衛.LC-MS技術在藤黃屬植物化學成分研究中的應用[J].世界科學技術-中醫藥現代化,2017,19(2):260-263.

[6]張寶軍,房慶偉,譚紅勝,等.高速逆流色譜快速分離山竹子素的制備方法實驗研究[J].世界科學技術-中醫藥現代化,2017,19(2):254-259.

[7]王英強,陳靜香,許碧爽,等.多花山竹子黃色素的提取及其穩定性的初步研究[J].仲愷農業技術學院學報,1997(2):86-91.

[8]楊志玲,王開良,譚梓峰,等.值得開發的幾種野生木本油料樹種[J].林業科技開發,2003(2):41-43.

[9]楊志玲.幾種野生木本油料及其經濟價值的研究[J].經濟林研究,2001(4):37-38.

[10]李秀全,徐有明.我國主要木本油料樹種資源開發與林業生物能源林建設的探討[J].生物質化學工程,2006(1):229-234.

[11]祿文林.木本油料樹種資源利用現狀與展望[J].陜西林業科技,2008(4):146-149.

[12]單永年,王永高.多花山竹子種子油的研究[J].江西林業科技,1985(5):46-49.

[13]文定青,酃明宏.海南島藤黃屬植物的分布及其區系特征[J].科技創新導,2008(3):245-246.

[14]劉子金,楊小波,林澤欽,等.10種藤黃科植物遺傳多樣性的ISSR分析[J].江蘇農業科學,2016(7):55-58.

[15]楊嶸.多花山竹子在三明園林綠化中的應用[J].現代園藝,2013(6):147.

[16]鄭小春,龔期繩.多花山竹子的播種育苗[J].林業實用技術,2003(7):26.

[17]劉勝洪,黃碧珠.多花山竹子(Garcinia multifloraChamp)的繁殖研究[J].中國農學通報,2004,20(6):93-93.

[18]李肇鋒,周俊新,黃華明,等.多花山竹子扦插繁殖技術研究[J].武夷學院學報,2015(12):8-11.

[19]王英強,馮穎竹.多花山竹子種子萌發及其幼苗生長分析[J].仲愷農業技術學院學報,1999,12(2):18-25.

[20]瞿學昌,宋墩福,彭麗,等.鄉土樹種多花山竹子育苗技術[J].林業實用技術,2009(9):38-42.

[21]傅家祥,賴錦良.多花山竹子育苗及移栽技術[J].中國林副特產,2015(2):48-49.

[22]梁稱福.植物組織培養研究進展與應用概況[J].經濟林研究,2005,23(4):99-105.

[23]顏敬昌.植物組織培養手冊[M].上海:上海科學技術出版社,1990:64-65.

[24]朱建華,彭士勇.植物組織培養實用技術[M].北京:中國計量出版社,2002:67-72.

[25]崔德才,徐培文.植物組織培養與工廠化育苗[M].北京:化學工業出版社,2003:33-34.

[26]陳紹煌.藥用植物組培快繁實務[M].北京:中國農業出版社,2014:180-185.

[27]羅士韋,許智宏.經濟植物組織培養[M].北京:科學出版社,1988:210-215.

[28]譚文澄,戴策剛.觀賞植物組織培養技術[M].北京:中國林業出版社,1991:290-297.

[29]陳正華.木本植物組織培養及其應用[M].北京:高等教育出版社,1994:56-65.

The Primary Culture Technology of Tissue Culture ofGarcinia multifloraChamp

Li Zhaofeng1,Huang Bihua2,Zhou Junxin1,Yu Rongzhuo1,Huang Huaming1
(1Fujian Forestry Vocational&Technical College,Nanping 353000,Fujian,China;2Fujian Forestry Science and Technology Test Center,Nanjing 363600,Fujian,China)

The study aims at providing references for the rapid propagation system establishment of tissue culture ofGarcinia multifloraChamp.By means of observing the comparative experiments,completely randomized orthogonal experiment design,analysis of variance(ANOVA),significance test and LSD multiply comparative analysis,the control of the most optimal sterilization time,the optimal primary culture medium type and hormone concentration formula were discussed.The results showed that when the sterilization time of explants was 2 min,the pollution rate was the highest,while the mortality rate and survival rate were relatively low.When the sterilization time was 6 min,the pollution rate and mortality rate were medium,while the survival rate was the highest.When the time was 10 min,the pollution rate and survival rate were the lowest,while the mortality rate was the highest.MS and B5 had better effect on the primary culture medium ofGarcinia multifloraChamp.If MS and B5 were respectively added with different concentrations of 6-BA and NAA,the induction effect of adventitious buds of explants was different.The maximum proportion of MS was 6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.9 mg/L,and the best ratio of B5 was 6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.6 mg/L.Taken together,the optimum sterilization time of explants is 6 min,MS+6-BA 1.6 mg/L+NAA 0.9 mg/L has the best culture effect.

Garcinia multifloraChamp;Tissue Culture;Breeding Technology;Orthogonal Test

S723.132

A論文編號：cjas17090017

福建省林業科研項目《多花山竹子種質資源篩選馴化與栽培技術研究》﹝閩林科〔2012〕2號)。

李肇鋒，男，1966年出生，福建尤溪人，副教授，碩士，長期從事森林培育和森林生態學教學與研究。通信地址：353000福建省南平市延平區海瑞路1號福建林業職業技術學院，Tel：0599-8467944，E-mail：544713197@qq.com。

2017-09-26，

2017-11-21。