豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結構蛋白nsp11結構與功能

姜 楠 ， 靳 換 ， 李 逸 ， 陳艷紅 ， 周 磊

(中國農業大學動物醫學院 , 北京 海淀 100193)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒非結構蛋白nsp11結構與功能

姜 楠 ， 靳 換 ， 李 逸 ， 陳艷紅 ， 周 磊

(中國農業大學動物醫學院 , 北京 海淀 100193)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)是一種嚴重危害生豬養殖的重要病原，以引起感染母豬繁殖障礙和各日齡豬只呼吸道癥狀為特征[1]。PRRSV病原具有免疫抑制、持續性感染和高度變異的特性，其在靶細胞(PAMs)中或體內的增殖能力能夠直接影響病毒的致病性，而病毒編碼的非結構蛋白(nsp)往往與病毒復制增殖能力密切相關[2]。此外，PRRSV所具有的免疫抑制特性也是影響其致病性的重要因素之一。PRRSV感染豬群往往表現出更嚴重的細菌繼發感染，同時PRRSV感染還可抑制其他疫苗的免疫效果。大量研究表明，PRRSV感染對先天性免疫反應具有明顯的抑制效果，尤其表現出對I型干擾素通路(IFN)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)，白介素分子(IL)具有下調作用，而多種病毒編碼的非結構蛋白參與該類拮抗效應[3]。因此，針對PRRSV非結構蛋白的結構功能的研究以及對其與宿主相互作用機制和調控宿主免疫通路的探索成為近年來的研究熱點，特別是對PRRSV非結構蛋白nsp11抑制先天性免疫通路、促進病毒復制增殖的分子機制研究以及其晶體結構的解析已成為重點突破方向，本文將對PRRSV nsp11研究領域的進展做一簡要綜述。

1 PRRSV非結構蛋白

PRRSV屬于套式病毒目，動脈炎病毒科,動脈炎病毒屬成員，基因組為單股正鏈RNA， 長度約為15 kb。含有至少12個開放閱讀框(ORF)，其中ORF1a編碼病毒復制酶多聚蛋白pp1a，其自剪切為nsp1α、nsp1β、nsp2-6，nsp7α、nsp7β和nsp8等非結構蛋白，其中通過-2型核糖體移碼可以形成新的nsp2亞型(nsp2TF)[4]。ORF1b可編碼4個非結構蛋白，即nsp9、nsp10、nsp11和nsp12。非結構蛋白具木瓜樣半胱氨酸蛋白酶(nsp1α)、半胱氨酸蛋白酶(nsp2)、3C樣絲氨酸蛋白酶(nsp4)、RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)(nsp9)、解旋酶 (nsp10)和核糖核酸內切酶(nsp11)等諸多功能，與病毒的復制增殖以及宿主的免疫調控相關[5]。

2 2Nsp11的酶活性研究

PRRSV nsp11的C′端含有NendoU活性結構域，其與來自非洲爪蟾的核糖核酸內切酶XendoU具有一定的親緣關系，屬于其家族成員。NendoU具有能夠特異性切割嘧啶堿基的核糖核酸內切酶活性，并參與細胞內小核仁RNA的加工。該區域在套式病毒目中較為保守，早期被認為是套式病毒的一個基因標志，目前冠狀病毒和動脈炎病毒的NendoU活性區已被鑒定，且通過點突變實驗證實，該區域在病毒復制和致病性中發揮著重要的生物學功能，但具體機制尚不明確。NendoU能夠切割RNA底物的3′端嘧啶，產生2′,3′環核苷酸和5′-OH端，對尿嘧啶的偏嗜性高于胞嘧啶，同時對單鏈RNA(ssRNA)的偏嗜性高于雙鏈RNA(dsRNA)，既對未配對嘧啶切割效率高于配對嘧啶[6-7]。NendoU 核糖核酸內切酶與RNA酶A(RNaseA)具有相似的催化機制，表現為在二者的三級催化中心兩個組氨酸(His)和一個賴氨酸(Lys)具有相似的空間構象，同時二者的切割產物具有一致性[7]。目前有研究表明，金屬離子在套式病毒目各成員的NendoU中發揮的作用并不相同，較低濃度的Mn2+離子能少量促進PRRSV和EAV NendoU的活性，濃度升高后反而抑制，該特性與SARS等冠狀病毒NendoU對Mn2+離子的依賴性并不相同[7]。

3 nsp11調控宿主先天性免疫的機制研究

3.1 nsp11 抑制I型IFN激活通路的研究 早期研究發現，具有RNase活性的病毒蛋白可通過降解RNA來抑制I型IFN的誘導。如瘟病毒屬的BVDV病毒的 Erns蛋白是在病毒膜表面具有RNase活性的糖基化蛋白，可將細胞外病毒RNA裂解，阻止病毒RNA與IFN激活通路中RNA結合受體TLR-3的結合，進而阻斷dsRNA介導的IFN信號通路激活[8]。同理，nsp11 中的 NendoU 具有相似的活性，能夠非特異性地抑制病毒RNA，繼而抑制RNA結合模式識別受體如 PKR，RIG-1/MAD5，TLR-3和TLR-7等分子的激活，從而導致IFN激活反應的抑制[9]。據報道，在nsp11表達細胞中，IFN啟動子和IRF3報告基因活性均被顯著抑制，且抑制活性是通過RIG-I信號通路介導的。nsp11介導的IFN抑制同樣可以被dsRNA激發，具有活性的組成型RIG-I和IPS-1，或IRF3作為誘導劑觸發。隨后的實驗表明，PRRSV nsp11可發揮阻斷IRF3的作用，抑制IRF3磷酸化，從而阻斷IRF3在細胞中的入核轉移。同時實驗還證實,nsp11的NendoU活性與IRF3激活的抑制有關，其活性的催化位點突變(H3735A，H3750A和H3779A)可導致nsp11的IFN抑制功能喪失[10]。除此之外，推測nsp11還有可能在JAK-STAT信號通路的轉導過程中或其他干擾素激活途徑中起抑制作用。

3.2 nsp11抑制NF-κB通路的研究 早期研究報告指出，PRRSV nsp11能夠減少NF-κB啟動子的激活[11]，華中農業大學肖少波教授團隊進一步研究表明，nsp11是一種去泛素化蛋白酶(DUB)，且活性強于PRRSV nsp2蛋白，其對K48連接形式的泛素化具有去泛素化酶活性，但對K63連接的多聚泛素無作用。Nnsp11 可以抑制SEV/poly(I∶C)誘導的β-IFN、NF-κB和IRF3的激活，并呈劑量依賴性。nsp11可通過去除I κBα上的K48鏈接泛素抑制 NF-κB激活。進一步構建了nsp11不同位點的突變體，發現nsp11的D144、K173、D180和Y219 位氨基酸對DUB活性至關重要，且DUB活性與其抑制NF-κB呈顯著相關性，但與其抑制IFN-β的能力不完全吻合，說明抑制IFN可能是其核酸內切酶活性與DUB活性的一種綜合效應[12]。

3.3 nsp11抑制IL-1β分泌的研究 據河南省農業科學院張改平院士團隊報道，在體外感染實驗中， PRRSV感染早期能夠通過NLRP3炎性體通路激活PAM靶細胞IL-1β的表達和分泌，但在感染后期，pro-IL-1β mRNA 和 IL-1β蛋白的表達水平開始降低，并降至mock感染組的水平，進一步分析發現，PRRSV nsp11蛋白的表達能夠抑制由LPS誘導的pro-IL-1β mRNA的轉錄和IL-1β蛋白的分泌[13]。

3.4 nsp11 抑制TNF-α轉錄表達的研究 中國農業大學楊漢春教授團隊用熒光素酶報告試驗證實，PRRSV的nsp7、nsp11和nsp12是不同致病性PRRSV毒株誘導TNF-α的mRNA差異表達的病毒蛋白。通過分析各個非結構蛋白對ERK信號通路的影響，發現高致病性PRRSV毒株的nsp1β和nsp11能抑制ERK信號通路，進而抑制TNF-α蛋白產生。運用反向遺傳技術同時置換高低致病性毒株間nsp1β和nsp11的拯救毒能反轉TNF-α蛋白差異表達的現象，證實nsp1β和nsp11在不同致病性PRRSV毒株誘導的TNF-α差異表達中發揮重要作用。其結果表明，HP-PRRSV通過其nsp11與nsp1β可有效抑制TNF-α產生，從而有利于其在宿主體內的復制，這可能是導致其致病性和毒力增強的機制之一[14]。

3.5 nsp11抑制RNA干擾相關分子的研究 PRRSV感染能夠通過下調RNA沉默通路中的重要分子argonaute protein-2 (Ago-2)的表達來抑制感染細胞內由short-hairpin (sh) RNA, double-strand (ds) RNA 和 microRNA (miRNA)引起的RNA沉默效應。同時如果使用siRNA 和shRNA下調MARC-145和PAM細胞中的RNA 沉默相關分子Dicer和Ago-2 能夠反過來上調PRRSV感染的病毒滴度。進一步研究發現，PRRSV的nsp11以及nsp1α的表達能夠抑制Ago-2的表達水平從而抑制細胞內RNA 沉默效應，這也是PRRSV與宿主協調進化的結果，使得病毒能夠突破宿主細胞的限制，創造一個適宜病毒增殖的細胞環境[15]。

4 nsp11的結構生物學特點

華中農業大學的彭貴青教授團隊在大腸桿菌表達系統中高效表達了PRRSV nsp11蛋白,通過晶體生長條件篩選，獲得較高衍射率的晶體(2.6A)，并首次成功解析動脈炎病毒的NendoU結構，證實nsp11 為一個奇特的與冠狀病毒核糖核酸內切酶nsp15存在顯著區別的不對稱二聚體結構，單體由17個β折疊和3個α螺旋組成，第74位絲氨酸以及76位苯丙氨酸對于二聚體的形成至關重要。進一步的分析發現,PRRSV nsp11二聚體形成的關鍵氨基酸對于核酸內切酶活性至關重要，生化及結構數據也表明了穩定的二聚體結構是nsp11發揮NendoU功能的結構基礎。此外，晶體結構證實了動脈炎病毒和冠狀病毒的核糖核酸內切酶關鍵的催化表位具有很高的結構保守性，從結構生物學的角度解析了為何兩者具有相似的RNA底物切割機制[15]。

5 總結與展望

綜上所述，PRRSV nsp11 含有NendoU結構功能域，具有RNaseA相似的核酸內切酶活性，其在套式病毒目中高度保守，且與病毒復制息息相關，但其詳細機制并不清楚。NendoU可通過其核酸內切酶活性，抑制dsRNA相關的模式識別分子激活通路，同時還可通過DUB活性抑制NF-κB通路的激活，從而抑制I型IFN的激活，創造利于病毒增殖的細胞環境。除以上研究所報道過的功能以外，nsp11是否還具有其他的生物學功能？當前，通過篩選和鑒定與nsp11相互作用的宿主細胞蛋白來間接揭示nsp11的靶向分子，進一步探究nsp11的生物學功能是一個重要切入點，可以為理解病毒的復制和致病機制奠定科學基礎。

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A

0529-6005(2017)08-0059-03

2017-06-23

國家自然科學基金項目(31302088)

姜楠(1994-)，女，本科生，就讀于動物醫學專業，E-mail：jiangnan314@126.com

陳艷紅，E-mail：chenyh@cau.edu.cn；周磊，E-mail: leosj@cau.edu.cn