急性肺損傷實驗動物模型的特征和評價方法

劉澤茹，宋 磊，李 丹

( 吉林大學第一醫(yī)院 呼吸內科，吉林 長春130021)

急性肺損傷實驗動物模型的特征和評價方法

劉澤茹，宋 磊，李 丹*

( 吉林大學第一醫(yī)院 呼吸內科，吉林 長春130021)

急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是指心源性以外的各種肺內、外致病因素導致的急性、進行性、缺氧性急性呼吸衰竭。急性肺損傷最嚴重的情況就是急性呼吸窘迫綜合征[1]。流行病學調查顯示ALI /ARDS是臨床常見危重癥，其發(fā)病機制目前尚不清楚，缺少敏感、特異的指標，使得治療上的總體預后改善并不大，因此動物模型為研究急性肺損傷提供了較大幫助。目前研究急性肺損傷的動物模型有鼠類、兔、犬、豬、綿羊、山羊及靈長類等動物，但由于動物和人的肺部解剖結構和對抗損傷的防御機制不同，比如人類急性肺損傷是彌漫性肺泡損傷(DAD)，以炎癥反應、肺泡間隔增厚、透明膜形成為主要特征[2]，而動物模型并不能復制這種病理特征，因此關于導致動物急性肺損傷的主要因素在科學界還未達成共識，人類急性肺損傷定義的標準也不能直接復制到大多數(shù)的急性肺損傷的動物模型中。本文主要對急性肺損傷動物模型的主要特征及其評價方法進行總結。

1 急性肺損傷動物模型的特征

理論上，急性肺損傷動物模型應該具備一項或多項人類急性肺損傷的特征，包括損傷后急性起病(數(shù)小時)、肺生理功能障礙(如氣體交換異常，肺順應性降低)、肺組織學損傷(內皮細胞、間質、上皮)和肺泡毛細血管膜通透性增加。目前，任何一個實驗動物模型都未能完全復制人類急性肺損傷的所有特征[3]。因此，明確與急性肺損傷相關的動物和人類之間的某些差異并對其進行比較尤為重要。

由于人類和動物的肺在解剖結構和生理功能上的不同，對急性損傷性刺激的反應亦不相同，因而對肺損傷的評價產生很大的影響。例如，小鼠的呼吸頻率(250-300 次/分)遠高于人類的呼吸頻率(12-16次/分)，致使絕對呼吸頻率不能作為評價小鼠急性肺損傷的指標。嚙齒類動物的肺和人類的肺在大體和顯微上有重要區(qū)別，當出現(xiàn)急性肺損傷時，在肺泡毛細血管膜通透性明顯增強的情況下小鼠的肺很少出現(xiàn)典型的透明膜[4]。另外，人類與嚙齒類動物炎癥反應中的細胞和體液的關鍵元素也有重要差異。例如，小鼠循環(huán)的中性粒細胞(10%-25%)比人類(50%-70%)少且不表達的防御素[5]。此外，對ALI/ARDS危重病人設置的許多干預措施在動物實驗中很難復制，如長時間通風或血流動力學支持等。

實驗動物研究常使用年輕無合并癥的老鼠，而人類肺損傷常見于老年人合并有多種疾病如糖尿病、冠狀動脈疾病、腎或肝功能不全等。鑒于這些因素的不同，無法預期人類和動物的肺對同種有害刺激的反應是否相同。

2 急性肺損傷動物模型的評價方法

實驗性急性肺損傷最主要的特征包括組織學損傷，肺泡毛細血管屏障改變，炎癥反應和生理功能障礙；確定急性肺損傷是否發(fā)生，至少需要下述4項特征中的3項。

2.1 組織損傷的測量

組織損傷被認為是急性肺損傷最相關的特征。為了方便鑒別暴露在灌注區(qū)域的肺組織，可以在灌注劑中添加膠體碳(1∶100稀釋)；膠體碳被常駐巨噬細胞吞噬后在細胞內出現(xiàn)黑點，可用于鑒別灌注劑是否進入食道。肺間隔厚度的評價依賴整個肺的膨脹性，由于技術的缺陷或氣道結構差異導致部分區(qū)域充氣不足，此區(qū)域肺組織切片肺間隔通常是增厚的。因此，只有肺間隔增厚大于或等于兩倍正常肺組織才在評價范圍之內。此外，評價肺間隔厚度時不應選擇鄰近血管或氣道的肺組織進行測量，由于支氣管血管膠原蛋白的存在這些部位的肺間隔通常是增厚的[6]。

2.2 滲透性變化的測量

大型動物如綿羊和山羊，可以收集肺淋巴液并測定淋巴液和血漿總蛋白濃度，兩者的正常比值約為0.50。油酸、內毒素、細菌，或酸吸入等危險因素使肺血管和上皮細胞通透性增加，淋巴液和血漿中的總蛋白比值通常不變。毛細血管通透性的變化也可用伊萬斯藍染料測定，這種方法因可在不使用放射性同位素的情況下測定滲透性而被廣泛使用。測定肺水含量也可計算濕干比重，對于體積非常小的肺，測量中微小的誤差就會導致濕干比出現(xiàn)很大變化。炎癥和肺上皮細胞產生的蛋白質對支氣管肺泡灌洗液中總蛋白濃度也有影響。動物肺水腫液的收集也可作為一種測量方法[7，8]，在實驗或臨床肺水腫的早期階段(第1個30 min)收集水腫液，則水腫液的總蛋白濃度可以與時間匹配的血漿樣本進行比較。如果該比率大于0.65，則反映了滲透率的增加。如果肺水腫液樣本收集于肺泡水腫發(fā)生后15-30 min，期間肺水腫液發(fā)生重吸收，這時肺泡蛋白濃度的測定結果將對肺水腫的發(fā)生產生誤導作用。

2.3 炎性反應的檢測

急性肺損傷常伴有肺部的炎癥反應。炎癥的檢測包括支氣管肺泡灌洗液(BAL)總中性粒細胞，髓過氧物酶(MPO)，炎性因子的檢測[9]。支氣管肺泡灌洗液的中性粒細胞很容易通過流式細胞儀運用特異性抗體Ly6G[10]識別。MPO被激活的中性粒細胞釋放，因此，檢測支氣管肺泡灌洗液中的MPO可作為肺泡活化中性粒細胞積累的替代。另外，整個肺組織MPO計量反映肺組織中性粒細胞的聚集，從而可作為支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞檢測的有效補充[11]。

2.4 氣體交換的測量

肺損傷模型中低氧血癥、肺-動脈氧分壓差增加被認為與生理功能障礙最相關。因此，在評估動物是否發(fā)生肺損傷時不能將氧合作為唯一的指標。在急性肺損傷的動物模型中，氧合可能會隨平均氣道壓力的變化而變化，亦可隨胸壁擴張度或體位變化而改變(例如，俯臥位與仰臥位)[12]。PaO2的降低未必意味肺損傷的惡化，卻可能提示血流動力學的惡化。體積相對大的動物測量動脈血氣較容易，體積小的動物(例如，小鼠)測量動脈血氣相當困難，特別是在實驗過程中需要反復進行測量時，且實驗動物模型受到一些因素影響，這些因素可能與ALI無關，包括鎮(zhèn)靜的程度，疼痛，體溫，酸-堿平衡等。

3 常見的急性肺損傷模型

檢索最近五年的文獻，高潮氣量或高峰值壓力的機械通氣，內毒素的肺部或全身給藥，吸入或滴注活菌為動物肺損傷的三種最常用的應用模型。

3.1 機械通氣致肺損傷模型 肺組織損傷通常表現(xiàn)為肺間隔增厚，肺泡中性粒細胞浸潤，透明膜常出現(xiàn)于大型的實驗動物模型，在大鼠或小鼠中很少出現(xiàn)。機械通氣模型中通過增加肺濕-干比重和微濾過系數(shù)可導致水及蛋白質滲透性增加，并可在支氣管肺泡灌洗液檢測到白蛋白或總蛋白濃度增加[13]。過度通氣所致血氧飽和度下降通常在數(shù)小時內即可導致嚴重的低氧血癥。大型動物對手術的耐受性好，機械通氣方面采用的較多[14]。隨著科技的進步，人類使用的呼吸機可廣泛應用于小型動物，這為今后開展小型動物急性肺損傷實驗進一步研究提供了幫助。

3.2 內毒素致急性肺損傷模型 內毒素致傷模型多采用脂多糖[15]。通過吸入、氣管內滴入，或靜脈滴注脂多糖導致肺組織損傷，通常在1 h內出現(xiàn)肺泡、間質中性粒細胞浸潤，肺泡壁增厚，肺泡腔水腫及蛋白質的積累[16，17]。內毒素致組織損傷依據(jù)肺泡及間質炎癥、出血、肺水腫、肺不張、透明膜形成和細胞凋亡評分[18，19]。肺濕干比重的增加，伊萬斯藍染液在肺中的積累，白蛋白和總蛋白在支氣管肺泡灌洗液中的積聚表明內毒素使蛋白和水的滲透性增加[20]支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞數(shù)目的增加，MPO活性增高、細胞因子水平增加及肺炎癥反應幾乎是各類型內毒素引起的肺損傷模型的炎癥反應的特征[20，21]，但低氧血癥很少出現(xiàn)。

3.3 活菌致肺損傷 制備活菌致肺損傷實驗動物模型常使用霧化吸入或直接將活菌灌入鼻腔、氣管或支氣管等方法。實驗動物模型的肺組織損傷常伴有肺泡和間質中性粒細胞浸潤、肺泡壁增厚和肺透明膜形成[22]。炎癥標志物、肺泡灌洗液中性粒細胞數(shù)增加、MPO活性和細胞因子水平增加及全身性低氧血癥，普遍存在于活菌誘導的肺損傷中。

4 結論

急性肺損傷是臨床常見的難治性并發(fā)癥之一，建立理想的急性肺損傷動物模型是了解ALI/ARDS發(fā)病機制和探索其治療方法的重要手段，目前，任何一種動物模型都不能充分復制出人類ALI/ARDS的全部特點，因此，選擇ALI的動物模型需要考慮每種模型的特點，以及與人類之間的差異性之后再做出決定。實驗動物模型仍存在很多限制，但隨著對急性肺損傷研究的深入，試驗方法不斷改進，動物模型的建立將更趨于完善，將對治療和預防ALI的發(fā)生與發(fā)展有重要的指導作用。

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本文受國家自然科學基金面上項目(81570002)與國家自然科學基金青年項目(81500051)資助

*通訊作者

1007-4287(2017)06-1100-03

2016-10-19)