新一代殺蟲劑
——在葉部能穩定應用的dsRNA

2017-01-12 03:40:47李本杰徐漢虹編譯

世界農藥 2016年6期

李本杰，徐漢虹編譯

(天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室華南農業大學，廣州 510642)

李本杰，徐漢虹編譯

(天然農藥與化學生物學教育部重點實驗室華南農業大學，廣州 510642)

在過去10年間，人類對RNA分子生物學的認識有了顯著的提高。其中一個重大的進步是RNA干擾(RNAi)的發現，RNA干擾是利用約18～30個核苷酸的非編碼RNA來調控基因和基因組的表達，調控可以發生在染色體合成、染色體分離、轉錄、RNA修飾和RNA 翻譯等過程中。小RNA一般抑制基因的表達和調控，此被稱為RNA沉默。

RNA干擾主要被用來研究細胞功能，即將目的基因沉默，然后研究基因沉默的影響。雖然目前對于RNA干擾技術來說，并不是每一種方法都能把dsRNA導入每種昆蟲、每個發育階段的蟲體或基因，但該技術仍然擁有非常廣闊的應用前景。

起初，進行昆蟲RNA干擾研究是直接將dsRNA注射到蟲體，故試驗需要較多的人力。在過去的6年間，通過其他方法獲得了許多RNA干擾試驗的成功。特別需要注意的是，其與作物保護具有相關性，研究發現數種昆蟲攝入體外合成的dsRNA能有效防治這些昆蟲。由此有人提出dsRNA可以被用于防治病害，應用于轉基因作物防治害蟲。研究發現在轉基因植物體內表達的dsRNA能夠使玉米根葉甲幼蟲發育不良和死亡，這啟發人們認為dsRNA可能會成為重要的害蟲防治方法。dsRNA具有高度特異性，以及表達dsRNA的轉基因作物不會產生引起過敏性反應的蛋白，這些都有力地支持了此觀點。

dsRNA的長度會影響RNA干擾的效果。飼喂研究中使用的dsRNA長度為134～1 842 bp，dsRNA的最佳長度由多種因素決定。到目前為止，很少對飼喂試驗所需dsRNA的最佳長度進行過系統評估研究。Bolognesi等人研究了不同長度dsRNA對南方玉米根蟲的影響，結果表明240 bp的dsRNA防治效果最好。

馬鈴薯甲蟲[Leptinotarsa decemlineata (Say)]隸屬于鞘翅目葉甲科，是馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)的主要害蟲，同時還可危害番茄(S. lycopersicum L.)、茄子(S. melongena L.)等茄科植物。馬鈴薯是馬鈴薯甲蟲的主要寄主，馬鈴薯在世界范圍內的廣泛種植，使馬鈴薯甲蟲短時間內就從美國西南部和墨西哥傳播到了歐洲、中東、中亞、和中國西部，并且有進一步擴散到亞洲其余地區、南美、非洲和大洋洲的趨勢。

馬鈴薯甲蟲取食量大，繁殖率高，傳播途徑廣，對馬鈴薯造成巨大危害。馬鈴薯甲蟲的防治主要依賴殺蟲劑，最初使用滴滴涕防治，但抗藥性問題很快凸顯。農藥對馬鈴薯甲蟲的高選擇壓力使馬鈴薯甲蟲對多種殺蟲劑產生了抗性和交互抗性，現在馬鈴薯甲蟲已經對大多數類型的殺蟲劑產生了抗藥性。僅在北美地區，馬鈴薯甲蟲每年造成的經濟損失和防治費用就在1億美元以上。

盡管dsRNA具有作物保護潛力，但這類分子(不是轉基因作物表達的dsRNA)在環境中不能長時間穩定存在，已有研究報道在土壤中dsRNA的半衰期很短。本文研究表明在溫室條件下，dsRNA葉部施用可以穩定存在28 d以上，并且隨著葉片干燥dsRNA并不會隨水分流失而消失。試驗結果證明了葉部施用dsRNA防治害蟲可行，拓寬了RNA干擾技術在植物保護領域的應用。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯甲蟲

試驗所用馬鈴薯品種為Yukon gold，溫室生長，種植于直徑10 cm的花盆內，種植土壤為郎伯土。馬鈴薯甲蟲飼養于養蟲籠內，用4周大小的馬鈴薯葉片飼喂，光周期12︰12(L︰D)，溫度恒定25 ℃。成蟲產卵后，將卵及時移于同樣的飼養條件下，觀察并記錄卵的孵化。小心的用干凈挑蟲筆將1齡幼蟲轉移到馬鈴薯葉片，挑選大小相同的2齡幼蟲稱重后繼續用于后續試驗。

1.2 馬鈴薯甲蟲肌動蛋白基因cDNA全序列的克隆

用TRIzolTM(Invitrogen, Carlsbad, CA)分離馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲的總RNA。為了確保樣品中不含有DNA，加入2 U/μL的DNase1(Ambion, Grand Island，NY)，在37 ℃反應1 h，然后用苯酚︰氯仿(24︰1)提取，再用氯仿提取。剩余的RNA用異丙醇沉淀，用70%乙醇沖洗，用不含核酸酶的水(Promega，Madison，WI)重新懸浮，濃度為0.2 μg/μL。參照文獻報道，用FirstChoice?RLM-RACE試劑盒(Invitrogen)和馬鈴薯甲蟲肌動蛋白基因的特異性引物進行5′和3′RACE反應(5′反應用CPB 肌動蛋白R，3′反應用CPB 3′RACE internal F)(表1)。用Wizard? SV凝膠及PCR純化系統(Promega)純化PCR電泳陽性條帶物質(含0.5 μg/mL嗅化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳)，在康奈爾大學基因組測序中心用相同的基因特異性引物測序。

以分離純化的RNA為模板，用GoScript?逆轉錄酶系統(Promega)合成cDNA第一鏈。進行PCR反應，其(50 μL)包含10 μM CPB 肌動蛋白F和CPB肌動蛋白R引物(表1)，1 μL cDNA第一鏈，25 μL2× GoTaq? Green Master Mix(Promega)，22 μL不含核酸酶的水(Promega)。PCR反應條件為：95 ℃預變性2 min；然后是95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行35個循環；最后72 ℃終延伸10 min。對適當大小的PCR產物切膠，純化，連接到pGEM?-T Easy 載體(Promega)，利用熱休克蛋白法轉化到JM109感受態細胞。菌落PCR驗證正確的陽性單克隆在含100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中培養過夜。使用Pure Yield? Plasmid Mini prep System (Promega)提取質粒，然后用載體引物SP6和T7測序驗證，得到馬鈴薯甲蟲激動蛋白基因的cDNA全序列，用DNASTAR Lasergene 11軟件對8個馬鈴薯甲蟲個體(2齡幼蟲、4齡幼蟲、蛹和成蟲各2個，不區分性別)的激動蛋白基因的cDNA全序列進行分析，比較序列之間的差異性，并組裝測序片段。

1.3 EGFP和家蠅肌動蛋白

選擇EGFP基因(U76561)作為陰性對照，以購買的質粒(Clontech, Madison, WI)為模板，PCR擴增EGFP片段(引物為EGFP F/EGFP R)(表1)，隨后連接到T-easy載體，并測序驗證。以T載體為模板，利用T7和EGFP T7R引物擴增EGFP基因5′端303 bp的片段(堿基對－3～300，從起始密碼子算起)，該片段被用于后續dsRNA的合成。

試驗所用家蠅為aabys品系。為了得到家蠅(Musca domestica)肌動蛋白的部分cDNA序列，首先提取家蠅成蟲的總RNA，反轉錄得到cDNA，過程同馬鈴薯甲蟲一致。根據一段未確定的序列(JN969088)設計引物Md Actin F和Md Actin R，擴增肌動蛋白基因片段(該片段在家蠅基因組位置為LOC101901018)，測序驗證后的片段作為合成353 bp dsRNA的模板(引物為T7和Actin T7 R353)。

1.4 dsRNA合成

用于dsRNA合成的PCR產物(馬鈴薯甲蟲、家蠅和EGFP)均以質粒為模板擴增的。PCR反應體系為GoTaq? Green Master Mix(Promega)、載體特異性的T7啟動子和基因特異性的反向引物T7啟動子。PCR反應條件為：95 ℃預變性2 min；然后是95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行35個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR終產物回收純化后用作dsRNA合成的模板，用AmpliScribeTMT7-flashTMtranscription kit (Epicentre，Madison，WI)進行合成。反應孵育時間增加至7 h，反應和純化均參照說明書進行。用添加0.5 μg/mL溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠電泳對純化的dsRNA定性，用分光光度計(NanoDrop 2000；NanoDrop Technologies，Wilmington，DE)定量。在合成所有dsRNA的過程中用到的引物列于表1。載體特異性的T7引物是引物對中的一個。因此，所有dsRNA(除了266 bp替代dsRNA)除了含有基因特異性的序列外還含有60 bp的載體序列。把含有該60 bp片段的從350 bp載體合成的dsRNA，單獨飼喂給2齡馬鈴薯甲蟲，對馬鈴薯甲蟲的生長和存活沒有影響(文中未列出數據)。用于和T7引物協同合成了以下區域的馬鈴薯甲蟲dsRNA的反向引物有：297 bp=CPB Actin T7 R297，208 bp=CPB Actin T7 R208，102 bp=CPB Actin T7 R102，50 bp= CPB Actin T7 R50，266 bp替代dsRNA=CPB Actin T7 R266A(CPB Actub T7 F2A為正向引物)。

1.5 室內飼喂試驗

用馬鈴薯葉片進行飼喂試驗：在一次性紙杯的底部鉆一個直徑12 mm的圓孔，放上一個裝滿水的8 mL的小瓶(Thermo Scientific，Rockwood，TN)，用封口膜封口。用鑷子在封口膜上扎一個小孔，然后將一片重約為1.3 g的馬鈴薯葉片(所有的葉片大小相近)的葉柄浸入水中。用吸管分別吸取200 μL液體(含5 μg actin-dsRNA、5μg EGFP-dsRNA 或蒸餾水)均勻涂抹在葉表面。干燥30 min后，每片葉接種2頭2齡馬鈴薯甲蟲。在紙杯口用穿孔塑料覆蓋后，用橡皮筋固定；置于光周期12︰12(L︰D)，恒溫25 ℃室內培養7 d，及時向樣品瓶內補充水分。4 d后，向每個處理添加未經處理的新鮮葉片。7 d后，記錄馬鈴薯甲蟲的重量、齡期和死亡率。

表1 試驗所用的引物序列

1.6 溫室試驗

分別用5 μg的馬鈴薯甲蟲actin-dsRNA、EGFP-dsRNA或自來水處理大小均一的馬鈴植株(生長4周的馬鈴薯)，然后用挑蟲筆小心的將預先稱重的馬鈴薯甲蟲接種到植株上，馬鈴薯甲蟲可以在植株上自由活動和取食。7 d后，從植株上移取馬鈴薯甲蟲，稱重，記錄重量、齡期和死亡情況。再選取2齡幼蟲接種到原植株上，飼養7 d。actin-dsRNA處理的植株上蟲口數為12～92頭，平均每株48頭，EGFP或自來水處理的對照組每株植物蟲口數4～24頭，平均每株15頭。當EGFP或水處理的對照組植株上幼蟲過多時，改用新的植株經相同處理后繼續作對照處理，馬鈴薯甲蟲actin-dsRNA處理的植株在整個試驗期間不更換(僅有2齡和3齡幼蟲取食)。試驗開始4周后，因為actin-dsRNA處理組植株受到溫室內的薊馬侵染而終止。每個處理含有5～22棵植株(總計3個重復)，整個試驗過程共重復6次。試驗分別在2月(冬季條件，重復3次)和8月(夏季條件，重復3次)進行，不同季節的試驗結果沒有明顯差異。晴天時，溫室外紫外線輻射量為(6.9±0.2) mW/cm2，室內為(2.8±0.1) mW/cm2。

1.7 葉片對dsRNA的吸收

在1.7 mL的樣品管內加入含有5 μg的馬鈴薯甲蟲actin-dsRNA(297 bp)或5 μg EGFP-dsRNA 200 μL的水溶液，將葉柄浸入液體中，設置清水為對照。約1 h后，葉片將樣品瓶內液體全部吸收后，繼續向瓶內添加200 μL原溶液，共重復添加5次，即葉片總計吸收1.2 mL溶液。然后將葉片用于飼喂試驗，驗證葉片是否可以通過這種方式吸收dsRNA。

1.8 葉片沖洗試驗

為了確定dsRNA是否可以在降雨條件下穩定存在，將葉柄按上述方法浸入含dsRNA的溶液中吸收1 h。1 h后，將葉片浸入250 mL清水中，并不斷振蕩，隨后干燥0.5 h，進行飼喂試驗。

1.9 紫外照射試驗

為了確定dsRNA在紫外照射下的穩定性，將含5 μg CPB actin-dsRNA(297 bp)或5 μg EGFP-dsRNA或自來水的200 μL水溶液加入玻璃滴試板(85 mm ×100 mm; Corning GlassWorks, Corning, NY)上，利用紫外交聯儀(Spectronics, Corp., Westbury, NY)分別照射0 h、0.5 h、1 h或2 h(254 nm, 1 500 μW/cm2)，用雙蒸水將各處理體積補足至200 μL。取10 μL處理液，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA完整性，剩余190 μL處理液均勻涂抹到馬鈴薯葉片上，然后進行室內飼喂試驗。

1.10 內吸性檢測

試驗選用生長在溫室中的4周的馬鈴薯植株，分別用5 μg的CPB actin-dsRNA(297 bp)或EGFP-dsRNA，以及自來水處理植株，每處理僅用藥液處理1個馬鈴薯植株的1片葉。試驗共分2組，第1組處理后立刻接種馬鈴薯甲蟲，第2組處理24 h后再接種。第1組EGFP-dsRNA或水處理(對照)的葉片上接種1頭2齡幼蟲，然后用穿孔的塑料膜將葉片密封，防止馬鈴薯甲蟲移動到其他未處理的葉片上；1頭2齡幼蟲接種于同一植株上未處理的葉片上。

2 結果與分析

2.1 CPB actin cDNA全長序列的克隆

以馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲的cDNA為模板，5′和3′RACE擴增得到了馬鈴薯甲蟲肌動蛋白基因的全長cDNA，5′RACE產物大小約為300 bp，3′RACE產物大小約為1 100 bp。利用引物CPB Actin F和CPB FLR進行PCR擴增，得到了actin基因的全長序列(GenBank accession number KJ577616)。通過與其他種類甲蟲的actin基因進行BLAST比對，確認克隆的cDNA是CPB actin基因序列。該肌動蛋白序列與先前確定的部分肌動蛋白基因序列完全相符，比較8個不同個體的全長cDNA序列，共發現4處堿基替換，分別是C99T(5個個體是C，3個個體是T)；A420G(4個A，3個G，1個異質結合)；C663T(7個C，1個是T)；C825T(7個是C，1個是T)。這些都是非同義突變，目前尚不清楚這些替換發生的原因。

2.2 濃度-反應生測

試驗結果表明，CPB actin-dsRNA有明顯的濃度-反應關系(表2)。每葉5 μg和10 μg的actin-dsRNA對馬鈴薯甲蟲幼蟲毒性很高，幼蟲取食10、5 μg CPB actin-dsRNA處理的葉片3 d內停止取食，4 d后，開始死亡，取食5 μg actin-dsRNA處理葉片的所有幼蟲都不能發育到4齡，體重輕，只有對照的8%，死亡率達到98%。2.5 μg actin-dsRNA處理組的幼蟲體重增長明顯受到抑制(分別是EGFP-dsRNA和水對照處理的39%和41%)，生長緩慢，有75%的幼蟲不能發育到4齡，死亡率達到77%。1.0 μg actindsRNA處理組的幼蟲體重增長也明顯小于2個對照組，并且葉片的消耗量明顯減少，但是沒有滯育和死亡現象發生。0.5 μg actin-dsRNA處理組與對照組沒有明顯差異。

表2 actin-dsRNA葉面施用后7 d對馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲的影響

CPB actin-dsRNA的生物活性(體重、發育和死亡)與肌動蛋白RNA雙鏈的長度呈負相關性(表3)。297 bp dsRNA處理組的死亡率高于208 bp dsRNA處理組，其余更短的dsRNA處理組在7 d后沒有蟲死亡。297、208 bp dsRNA處理組的幼蟲均不能發育到4齡，102 bp dsRNA處理組僅有45%的幼蟲能夠發育到4齡，50 bp dsRNA處理組同對照組一樣，所有幼蟲均能生長到4齡。297、208、102 bp dsRNA處理組明顯抑制了幼蟲的體重增長，其次是50 bp dsRNA處理組，這些處理組的幼蟲體重增長量均明顯低于對照組。dsRNA 266-A(改變dsRNA合成的模板區域)(圖2)處理組對馬鈴薯甲蟲的生物活性效果與297 bp dsRNA處理組基本相同。家蠅353 bp actindsRNA(與馬鈴薯甲蟲actin dsRNA序列相似度80%)處理組對馬鈴薯甲蟲的體重和死亡有重要的影響(表2和表3)。

2.3 溫室飼喂試驗

CPB actin-dsRNA處理馬鈴薯植株葉片后，對其保護作用至少能持續4周(表4)。actin-dsRNA處理4周后，同處理后1、2、3周一樣，明顯抑制了馬鈴薯甲蟲體重增長，造成馬鈴薯甲蟲滯育和死亡(表4)。用5 μg actin-dsRNA處理葉片后，將2齡幼蟲置于葉片上后，在2～3 d內停止取食。actin-dsRNA處理后3 d內幼蟲停止取食，與對照處理相比，植株受損非常小。圖4展示了actin-dsRNA對馬鈴薯植株保護作用，actin-dsRNA處理組的葉片受損很小，并且可以繼續生長，但對照組的葉片已經幾乎全部脫落。

表3 不同長度actin-dsRNA葉面施用后7 d對馬鈴薯甲蟲2齡幼蟲的影響(劑量5 μg/葉)

表4 溫室條件下dsRNA的穩定性

2.4 葉片對dsRNA的吸收

將馬鈴薯葉柄浸入含actin-dsRNA的溶液，通過飼喂試驗分析葉片能否通過葉柄吸收dsRNA。試驗結果列于表5。由試驗可知，與EGFP-dsRNA和清水對照相比，actin-dsRNA處理組的馬鈴薯甲蟲幼蟲體重增長明顯受到了抑制，分別為EGFP-dsRNA和清水對照的25%和24%，有49%的幼蟲不能正常發育到4齡，23%的幼蟲死亡。這說明水中的dsRNA能被葉柄吸收運輸到葉片。但是通過葉柄吸收對馬鈴薯甲蟲的防治效果不如葉面施用高。

表5 葉柄吸收dsRNA

2.5 葉片沖洗試驗

由試驗結果(表6)可知沖洗組和未沖洗組在抑制幼蟲體重增長、滯育和致死效果沒有明顯差異，這表明dsRNA并沒有被水顯著地沖洗掉，actindsRNA處理組對馬鈴薯甲蟲的防治效果明顯優于對照組。

表6 dsRNA被葉片吸收后被水沖淋的穩定性

2.6 紫外照射下dsRNA的穩定性

室內飼喂試驗和瓊脂糖凝膠電泳的結果均表明：將CPB actin-dsRNA置于玻璃皿表面，用254 nm紫外線(光強1 500 μW/cm2)照射數小時后，dsRNA就會失去活性(表7)。紫外照射30 min后，雖然電泳結果顯示dsRNA已經有部分降解，但飼喂試驗結果表明actin-dsRNA的活性并沒有受到影響。紫外照射1 h的actin-dsRNA處理的葉片飼喂試驗中，馬鈴薯甲蟲幼蟲體重增長明顯受到了抑制，分別為EGFP-dsRNA和清水對照的27%和26%，有44%的幼蟲不能發育到4齡，31%的幼蟲死亡。試驗所用的紫外交聯儀發出的紫外強度是地球表面紫外線強度的1.5倍。

表7 紫外處理后dsRNA的穩定性

圖1 2齡馬鈴薯甲蟲取食經actin-dsRNA處理葉片7 d后，出現滯育和死亡現象

圖2 馬鈴薯甲蟲肌動蛋白基因序列縮略圖

圖3 用作dsRNA合成模板的馬鈴薯甲蟲和家蠅肌動蛋白基因序列比對(二者的相似度80%)

2.7 內吸性

將2齡幼蟲分別接種到同一植株不同葉片(用actin-dsRNA處理和未用actin-dsRNA處理)后，只有actin-dsRNA處理葉片上的幼蟲受到了影響，其余幼蟲(actin-dsRNA處理后立刻接種到未處理葉片和處理24 h后接種到未處理葉片)均沒有受到影響(表8)。

圖4 不同處理的葉片受損對比(actin-dsRNA處理葉片受損程度明顯小于對照組)

表8 dsRNA處理葉片后，不能對同一植株上的非處理葉片提供保護a

3 討論

試驗結果證明了dsRNA葉部施用足夠穩定，溫室條件下持效期在28 d以上。在施藥后28 d植株的高度增加了1倍，但dsRNA仍然保持著非常高的活性。溫室試驗的結果表明dsRNA在田間條件下同樣有效，因為dsRNA一旦在葉片上干燥后不易被水沖淋掉。dsRNA不被水沖淋掉的原因尚不清楚，可能是因為馬鈴薯葉片上大量存在的毛狀體吸附了dsRNA，或者是因為dsRNA進入了植株內部，這些都需要進一步的研究還需要進一步研究在田間條件下dsRNA施用于不同種類植物表面的半衰期。在dsRNA商品化之前，需要開發dsRNA經濟有效的批量生產方法。dsRNA在葉片施用后沒有內吸性，需要開發合理的施藥方式，使dsRNA能完全覆蓋葉片，從而使防治效果最大化。actin-dsRNA的葉用量多于5 μg時，其防治效果與5 μg/葉的處理沒有明顯差異，害蟲的取食時間也沒有減少。這說明5 μg/葉為actin-dsRNA的最佳使用量。本文中沒有測定actin基因的表達量，但先前的研究表明馬鈴薯甲蟲食用CPB actin-dsRNA后，actin基因的表達會受到抑制，這可能就是dsRNA的作用機制。

馬鈴薯葉片能夠通過葉柄有效地吸收dsRNA，但對馬鈴薯甲蟲的防治效果明顯低于葉片直接施藥的。Hunter等證明了dsRNA能夠被根吸收，但尚不明確這種轉運方式的效率，以及這種施藥方式防治害蟲所需的dsRNA的量，需要進行大量的工作進行研究。

紫外光照能破壞核酸，故常用紫外線來殺菌。假設dsRNA在環境中不能穩定存在，Keri San Miguel等人研究了破壞dsRNA所需要的紫外光量。結果表明紫外照射1～2 h，在飼喂試驗中dsRNA就對2齡馬鈴薯甲蟲無活性。溫室條件下actin-dsRNA的活性至少可保持4周，說明在葉表面的dsRNA要比用于紫外照射穩定性研究的玻璃表面上的dsRNA穩定。

dsRNA能夠被植株的根吸收，然后運輸到葉，但不清楚dsRNA被葉片吸收后，能否運輸到未處理的葉片。溫室條件下的內吸性試驗結果顯示，dsRNA處理一部分葉的植株上的非處理葉片對馬鈴薯甲蟲沒有影響。這說明dsRNA不能從一個植株的處理葉轉移到非處理葉，或從處理葉轉移到非處理葉的dsRNA的量很少，不足以產生生物活性。

本試驗用肌動蛋白證明了dsRNA用于害蟲防治的穩定性，但由于不同物種間肌動蛋白基因具有高度相似性，所以試驗所用的肌動蛋白可能在實際應用中并不是最佳選擇。例如，家蠅的肌動蛋白與馬鈴薯甲蟲的相似度為80%，而家蠅的actin-dsRNA對馬鈴薯甲蟲仍然有很高的生物活性。盡管可以通過精心選擇dsRNA靶標基因區域，來提高dsRNA的物種特異性，但如果要實現種特異性害蟲防治的目標，就需要選擇在不同種間序列保守性低的基因做模板，合成專用于防治某一種生物的dsRNA。