生物酶提取申嗪霉素工藝的研究

姚陳偉

(上海農樂生物制品股份有限公司，上海201419)

生物酶提取申嗪霉素工藝的研究

姚陳偉

(上海農樂生物制品股份有限公司，上海201419)

申嗪霉素是一種廣譜抗真菌類微生物源抗生素，在田間使用中低毒、無殘留。研究了生物酶法提取申嗪霉素精品，利用生物酶安全環保無毒性的特點，在不同溫度和添加量的情況下，研究溶解酶和凝聚酶的最適溫度和最佳添加量。結果表明，溶解酶30 ℃、添加量7%和凝聚酶25 ℃、添加量6%時，采用這一提純工藝方法可以顯著提高申嗪霉素的純度，純度達到90%以上。

申嗪霉素；溶解酶；凝聚酶；安全；環保；純度

申嗪霉素(phenazine-1-carboxlic Acid，PCA)是熒光假單胞菌分泌的一種微生物源殺菌劑，具有廣譜抗菌作用，能夠預防和治療多種農作物根際土傳病害和多種真菌病害(如西瓜枯萎病、辣椒疫病、小麥根腐病、水稻紋枯病、水稻稻曲病、水稻稻瘟病等)。同時，申嗪霉素具有毒性低、對生態環境友好，在農作物中殘留少，用量少，效果好等特點。

圖1 申嗪霉素結構式

申嗪霉素市場前景廣闊。它的制劑為水懸浮劑，為水基化環保新劑型。這種劑型對申嗪霉素原藥的純度要求很高，如果申嗪霉素原藥的純度達不到要求，就會嚴重影響水懸浮劑產品的質量穩定性。經過創新生物技術的菌株改造、優化、篩選，申嗪霉素產品技術水平不斷提升，目前大生產中申嗪霉素的發酵單位可達5 000 mg/L以上。但是申嗪霉素發酵液成分復雜，培養基殘渣、菌絲體和大量的雜質都使得發酵液的提取變得困難重重，要想得到純度高的申嗪霉素更是難上加難。因此取得高純度的申嗪霉素原藥，必須進行高難度的技術攻關。

申嗪霉素是一種完全自主創新的生物農藥，目前對申嗪霉素的分離和純化的研究非常有限，研究人員還是采用化學法提純工藝。化學法提純工藝中使用的化學有機溶劑具有脂溶性，除經呼吸道和消化道進入人體外，還可經皮膚被人體迅速吸收。化學有機溶劑進入人體后將作用于富含脂類物質的神經、血液系統，以及肝腎等實質臟器，對人體造成直接傷害。化學有機溶劑對皮膚和黏膜也有明顯的刺激性，并對人體有致癌、致突變、致畸變的嚴重危害。據世界衛生組織估計，發展中國家每年約有50萬人遭受化學物質危害，有近5 000人死亡。除此以外，化學有機溶劑的使用對環境的破壞作用嚴重。更加之，化學有機溶劑的生產也是重要的安全隱患源，是造成安全事故的重要原由。在申嗪霉素產品的生產過程中，采用安全環保的提純工藝刻不容緩。

經過技術創新，申嗪霉素的提取技術有較大的提高。從綠色、生物的角度出發，以生物酶為主要的介質，進行申嗪霉素發酵液的分離，并不斷優化目的物質的提純工藝，使產品的純度達到預定的指標。

生物酶是一種無毒、對環境友好的生物催化劑，其化學本質為蛋白質。生物酶的生產和應用，在國內外已具有80多年歷史。20世紀80年代后，酶的制造和應用領域不斷擴大。生物工程作為一門新興高新技術在我國得到了迅速發展，酶在發酵工業中的應用日漸成熟。現在生物酶處理工藝已被公認為是一種符合環保要求的綠色生產工藝，它使發酵工業工藝得到改善和提高。同時生物酶具有無毒無害，可生物降解，對環境無污染，有利于生態的維護，生產過程安全等很多優點而成為發酵液提取工藝創新研究的熱點。

筆者采用生物酶降解分離純化法，能夠有效解決分離純化和環境保護、安全生產等諸多難題，并且以較低的成本獲得較高純度的申嗪霉素。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

⑴ 申嗪霉素粗品(上海農樂生物制品股份有限公司自行生產)

申嗪菌株搖瓶培養后經20 t發酵罐罐體發酵，發酵液簡單固液分離烘干后，粉碎得到申嗪霉素粗品。

⑵ 生物溶解酶RJM02、凝聚酶NJM05(上海農樂生物制品股份有限公司)、化學試劑乙腈、冰乙酸。

1.2 試驗設備與分析儀器

高效液相色譜儀(島津)、C18柱、臺式離心機(TGL-16B，上海安亭科學儀器廠)、超聲波清洗器(2101T，上海安譜科學儀器有限公司)、隔膜真空泵(GM-0.15，天津市騰達過濾器件廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1 粉碎、溶解

將含量在40%～50%左右的申嗪霉素粗品進行粉碎，加水攪拌稀釋，添加水量按照100倍的液固重量比例，加水后攪拌2～3 h使其充分溶解。

考察在不同溫度以及不同添加量的條件下添加溶解酶RJM02，研究申嗪霉素的溶解性，找出最適溫度和最佳添加量。添加時攪拌器的攪拌速度為200 rpm，攪拌時間為0.5 h，使稀釋液充分溶解，該程序完成后進行板框過濾，過濾壓力0.1 MPa，收集過濾液備用。

1.2.2 過濾液結晶

對不同溫度下生物凝聚酶NJM05(上海農樂生物制品股份有限公司生產)的活性進行研究，生物凝聚酶NJM05加入量為5%～7%(重量比計)，在最適溫度和最佳添加量條件下添加凝聚酶。加入時以100 rpm轉速攪拌使之均勻，攪拌時間為2 h，攪拌完成后靜置6 h使之充分結晶，然后板框過濾，過濾時板框壓力為0.05 MPa。

1.2.3 烘干、粉碎成品

結晶液過濾板框后，申嗪霉素結晶品形成濾餅留在板框濾布上，收集結晶品，然后將結晶品送入烘房烘干，粉碎，就得到需要的成品。

1.2.4 測定

HPLC法測定申嗪霉素的效價(含量)。色譜條件：C18柱，流動相(體積比，乙腈︰水︰冰醋酸= 40︰60︰0.2)，檢測波長：248 nm，流速1 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。

取溶解液40 μL于1.5 mL離心管中，加入960 μL乙腈超聲溶解5 min，離心機10 000 rpm離心5 min，取離心管上清液進樣，檢測，PCA含量為90%左右。

2 結果與討論

2.1 生物溶解酶作用溫度選擇

生物酶主要作用機理是誘導契合，當底物結合到酶的活性部位時，酶的構象有一個改變。底物誘導酶蛋白構象的變化，導致催化基團的正確定位與底物結合到酶的活性部位上去。

圖2 PCA液相檢測圖譜

表1 不同溫度下RJM02對申嗪霉素的水解作用

在30 ℃左右時，底物能夠最大限度與酶結合，說明在此溫度下酶的活性最高，能夠有效結合目標產物。

2.2 凝聚酶作用的最適溫度

凝聚酶于水中與目標產物發生酶促反應，凝聚成晶體使之發生沉淀。申嗪霉素形成有效結晶體之后通過板框過濾，形成的濾餅即為純度較高的申嗪霉素。

絮凝酶NJM05在溫度25 ℃，添加量6%時，申嗪霉素能夠最大限度形成有效晶體，回收率最高。

3 結 論

試驗研究表明，溫度為30 ℃時申嗪霉素在溶解酶RJM02作用下保持溶解，然后用生物絮凝酶NJM05在25 ℃左右結晶，能以最大收率回收目標產物，目標產物純度為90%左右。生物酶工藝達到了提取純化申嗪霉素和保護環境，安全生產的多重效果。

表2 NJM05在不同溫度下的結晶效果

試驗表明，生物酶技術在改進生產工藝，節約能耗，安全生產，減少環境污染，提高產品質量，增加附加值和開發新型原料的產品等方面都具有獨特的優勢。隨著技術的進步，生物酶技術將在各種領域的工程技術中得到更廣泛的應用。

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Study on the Application of the Biological Enzyme in the Extracting Process of Phenazine-1-carboxylic Acid

YAO Chen-wei
(Shanghai Nongle Biological Products Co., Ltd., Shanghai 201418, China)

Phenazine-1-carboxylic acid is a broad-spectrum antifungal microbe derived antibiotics in the field are in use, low toxicity and no residue. This paper studies the enzymatic extraction of phenazine-1-carboxylic acid products, using non-toxic environmentally safe biological enzyme, in different temperature and adding quantity, the optimum temperature and optimum amount study on the dissolving enzyme and condensed enzyme. The experiment showed that lytic enzyme addition of 7% at 30 ℃ and at 25 ℃ 6% addition of enzyme condensation, the purification process can significantly improve the purity of phenazine-1-carboxylic acid, reached more than 90%.

phenazine-1-carboxylic acid; dissolve enzyme; condensation enzyme; security; environmental protection; purity

10.16201/j.cnki.cn31-1827/tq.2016.06.04

TQ450

：A

1009-6485(2016)06-0025-03

姚陳偉(1982—)，男，漢族，工程師，主要從事細菌、放線菌的培養和工業化生產工作。Tel： 021-37571353，E-mail： gxjcxp@126.com。

2016-10-25。