硫酸軟骨素對低營養狀態下SH-SY5Y細胞保護作用的觀察

劉明海 吳昌學 葉凌 劉楊 陳量 劉艷潔△

(1.貴陽市花溪區人民醫院神經內科，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學病理教研室，貴州 貴陽 550004)

硫酸軟骨素對低營養狀態下SH-SY5Y細胞保護作用的觀察

劉明海1吳昌學2葉凌1劉楊3陳量3劉艷潔3△

(1.貴陽市花溪區人民醫院神經內科，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫科大學分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學病理教研室，貴州 貴陽 550004)

目的 通過觀察硫酸軟骨素對體外培養SH-SY5Y細胞株生長狀態、細胞生存率和超微結構的影響，探討硫酸軟骨素對腦神經細胞生長促進作用及損害的保護作用。 方法 培養SH-SY5Y細胞，觀察正常SH-SY5Y細胞、低營養處理及硫酸軟骨素處理SH-SY5Y細胞的形態及細胞活力。用光學顯微鏡及透射電子顯微鏡觀察各組細胞形態及超微結構改變，用MTT法檢測細胞生存率。結果 硫酸軟骨素處理組SH-SY5Y細胞較低營養處理組細胞生長狀態好，細胞形態完整，低營養處理組存活細胞數量減少，突起減少、變短；電鏡觀察低營養處理組細胞中內質網、高爾基體及線粒體腫脹呈空泡狀，部分細胞破裂成碎片，正常對照組和硫酸軟骨素處理組細胞結構完整，內質網、高爾基體及線粒體結構正常；細胞存活率低營養處理組較對照組明顯降低，相同培養時間內存活細胞數量較少，而硫酸軟骨素處理組較對照組和低營養處理組存活率明顯升高，存活細胞數量明顯增多。結論 硫酸軟骨素可延長SH-SY5Y細胞生存時間，可維持和改善低營養狀態下SH-SY5Y細胞形態及生理功能。硫酸軟骨素對保護和促進神經細胞生長具有一定作用。

SH-SY5Y細胞； 硫酸軟骨素； 細胞生存率； 超微結構

近年研究表明，硫酸軟骨素作為細胞外基質中主要的組成成分對細胞的生長及存活具有十分重要的作用。硫酸軟骨素作為抗動脈硬化和阿爾茨海默病的輔助藥物在臨床中也得到應用。硫酸軟骨素有緩和的抗凝血作用，在體內與蛋白質形成硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs),CSPGs可減弱β-淀粉樣蛋白對海馬神經元的破壞作用，并可迅速降解酪氨酸，防止酪氨酸對神經細胞的破壞作用，增強神經元的活性。腦缺血缺氧引起腦組織及功能損害在臨床極為常見。關于硫酸軟骨素對腦缺血導致神經細胞損害的保護作用方面的研究較少，本研究旨在通過硫酸軟骨素對體外培養SH-SY5Y細胞株生長的影響，探討其對神經細胞的保護作用，為進一步研究大腦損害的治療及臨床用藥提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

培養細胞和培養細胞試劑：SH-SY5Y細胞(購自德國German Collection of Microorganisms and Cell Cultures 公司)；DMEM 培養液(購自英國 Gibco Invitrogen 公司)；胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)及培養細胞用青霉素—鏈霉素(購自美國Hyclone 公司；3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5- 二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT](購自美國Sigma公司)；硫酸軟骨素注射液(湖南康普藥業有限公司)；H-7650 透射電鏡( 日本日立公司 )；ELX 800酶標儀(美國Bio-Tec公司)。

1.2 方法

1.2.1 SH-SY5Y細胞培養 將凍存SH-SY5Y細胞株復蘇，并于37 ℃ CO2培養箱中培養，24 h后換培養基(含10%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM)繼續培養。觀察細胞生長狀態，待細胞長滿培養瓶底傳代繼續培養。正常對照組細胞用完全培養基(含10%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM)培養，低營養處理組細胞用完全培養基(含5%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM)培養，硫酸軟骨素處理組細胞用0.4 mg/mL硫酸軟骨素處理(含5%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM)培養96 h以上。

1.2.2 細胞存活數量觀察 觀察相同培養時間內正常組SH-SY5Y細胞，低營養組細胞和經硫酸軟骨素處理組細胞的數量，并進行對比。計數前換液，用0.25%胰酶進行消化5 min，貼壁細胞脫落形成細胞懸液后，用移液器將細胞分散均勻，用血球計數板計數。

1.2.3 MTT實驗 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100 μL，鋪板時使待測細胞密度達1 000～10 000 孔(邊緣孔用無菌PBS填充)；5%CO2，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板)，加入濃度梯度的藥物，每孔100 μL，設3個復孔；5%CO2，37 ℃孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察；每孔加入0.5%MTT溶液(5 mg/mL)，繼續培養4 h。若藥物與MTT能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS沖2～3遍后，再加入含MTT的培養液；終止培養，小心吸去孔內培養液；每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570 nm處測量各孔的吸光值；同時設置調零孔(培養基、MTT、二甲基亞砜)、對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、二甲基亞砜)。

1.2.4 電子顯微鏡觀察細胞處理 PBS清洗細胞兩次，刮取細胞并用PBS形成細胞懸液，離心(800～1 000 r/min)獲得細胞沉淀，棄去PBS，用電鏡固定液重懸細胞，4 °C保存待檢。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 細胞生長狀態觀察

相同培養時間內與對照組比較，低營養處理組細胞生長狀態明顯下降，細胞數量及細胞突起明顯減少；經硫酸軟骨素處理的SH-SY5Y細胞生長狀態良好，細胞數量多，突起多有分枝并交織成網狀。

2.2 細胞生存時間觀察

從表1可見，培養72 h后，對照組細胞及低營養組細胞存活率均明顯下降，細胞計數存活細胞數量也明顯下降；硫酸軟骨素處理組細胞存活率較對照組及低營養處理組都明顯升高，細胞計數存活細胞數量明顯升高。

分 組 細胞存活率細胞計數(×106個/mL)對照組(10%FBS)0.25±0.037.2±1.5低營養處理組(5%FBS)0.05±0.02a2.2±1.3a硫酸軟骨素處理組(0.4mg/mL)0.85±0.23ab7.8±1.4ab

注：與對照組相比，aP<0.05；與低營養處理組相比，bP<0.05。

2.3 MTT實驗檢測各組細胞存活率

從表2可見，細胞經不同濃度硫酸軟骨素處理培養72 h后，隨著硫酸軟骨素處理濃度升高，細胞存活率逐漸升高，當處理濃度達到0.80 mg/mL時細胞存活率未見明顯升高。

表2 細胞存活率觀察

2.4 電子顯微鏡觀察

從圖2可見，細胞經硫酸軟骨素處理形態與對照組細胞無明顯差異；電鏡觀察顯示，細胞核、線粒體結構清晰，硫酸軟骨素處理細胞內吞飲小泡較多。

圖2 細胞超微結構觀察

3 討 論

硫酸軟骨素是細胞外基質中主要的組成成分，對細胞的生長及存活具有十分重要的作用。CSPGs可減弱β-淀粉樣蛋白對海馬神經元的破壞作用，迅速降解酪氨酸，防止酪氨酸對神經細胞的破壞作用，增強神經元的活性。CSPGs能激活胞內蛋白激酶，增加DNA和RNA合成，加速蛋白合成，從而促進海馬與神經軸突等神經細胞的生長，修復受損的中樞神經系統，促進神經突起的再生長。因此，硫酸軟骨素對受損的腦細胞具有支持存活、延緩死亡、增強修復和再生的能力[1-2]。

以往臨床治療中硫酸軟骨素主要用于降血脂、軟化血管和抗動脈粥樣硬化，隨著對細胞外基質作用研究的不斷深入，其應用范圍也日益廣泛，在神經性頭痛、神經退行性病變治療中也取得一定效果。但也有研究表明，在治療過程中，過度表達的硫酸軟骨素會促進角質瘢痕形成，抑制神經元軸突及突觸的生長，在神經損害修復中起到了負面作用[3]。所以，對硫酸軟骨素在神經損害后作用機制的研究對臨床安全用藥具有十分重要的意義。研究顯示，腦缺血缺氧后神經元中線粒體融合受到阻礙，導致線粒體形態異常及功能障礙[4]。急性缺血大鼠腦皮質神經元內也觀察到線粒體、內質網擴張，高爾基體結構不清[5]。我們的研究結果亦顯示，低營養處理組SH-SY5Y細胞線粒體、內質網擴張，高爾基體腫脹，而硫酸軟骨素處理組細胞超微結構腫脹擴張較少；檢測細胞生長狀態和活力發現，硫酸軟骨素能較好地維持SH-SY5Y細胞生長狀態，延長細胞在低營養狀態下的生存時間，說明藥物對細胞具有一定保護作用。以往研究認為，硫酸軟骨素對腦缺血損害的主要作用體現在緩和的抗凝血、溶栓、通栓及改善腦血管微循環方面。研究表明，每1 mg硫酸軟骨素A相當于0.45 U肝素的抗凝活性，這種抗凝活性并不依賴于抗凝酶Ⅲ而發揮作用，它可以通過纖維蛋白原系統而發揮抗凝血活性，因此具有溶栓、通栓作用[6]。因此，硫酸軟骨素能夠改善腦血管的微循環，增加腦組織灌流量，改善腦缺血。作為重要的細胞外基質，它對神經細胞的生存內環境可產生直接影響，本研究結果顯示硫酸軟骨素對體外培養細胞生長有促進作用，對低營養損害有一定保護作用。但鑒于硫酸軟骨素過量表達會抑制神經元生長并形成角質瘢痕，所以將其作為腦損害治療藥物的用量及用藥時機還有待進一步深入研究。

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Observation of protective function of chondroitin sulfate proteoglycans in SH-SY5Y cell treated with low serum medium

LiuMinghai1,WuChangxue2,Yelin1,LiuYang3,ChenLiang3,LiuYanjie3.

1.DepartmentofNeurology,HuaxiDistractPeople'sHospitalofGuiyangCity,Guiyang550004,China. 2.KeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China. 3.DepartmentofPathology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To investigate the protecting function of chondroitin sulfate proteoglycans in neuron injury, through observing growth state, survival rate and ultrastructure of SH-SY5Y cell line treated with chondroitin sulfate proteoglycans. Methods To observe the difference between normal SH-SY5Y cell and the cell line treated with sulfate proteoglycans and low serum medium, to observe morphology by light microscopy and electron microscopy, to observe survival rate of cell line by MTT. Results The growth of SH-SY5Y cell treated with sulfate proteoglycans was greater than normal SH-SY5Y cell and cell treated with low serum medium. The shorter neurite and decreased amount was observed in SH-SY5Y treated with low serum medium, mitochondrial, golgi and endoplasmic reticulum swelling was observed by electron microscopy, but the impairment of ultrastructure in SH-SY5Y cell treated with chondroitin sulfate proteoglycans was slighter than SH-SY5Y cell treated with low serum medium. The higher survival rate and amount of living cells was observed in SH-SY5Y cell treated with chondroitin sulfate proteoglycans than SH-SY5Y cell treated with low serum medium and control. Conclusion The chondroitin sulfate proteoglycans can protect neuron improve survival rate of the neurons and decrease impairment.

SH-SY5Y cell; Chondroitin sulfate proteoglycans; Survival rate Ultrastructure

國家自然科學基金(81260417)；貴州省科技廳貴州醫科大學聯合基金[黔科合LG(2012)006號]

R392.12

A

1000-744X(2016)02-0146-03

2015-08-05)

△通信作者，E-mail：lyj_liuyanjie@hotmail.com