胰腺癌患者尿液的代謝組學初步研究

田舍 江建新 張浩 張宏 劉興貴

(貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550004)

·技術與方法·

胰腺癌患者尿液的代謝組學初步研究

田舍 江建新 張浩 張宏 劉興貴△

(貴州醫科大學附屬醫院，貴州 貴陽 550004)

胰腺癌；尿液； 代謝組學; 質子核磁共振; 非損傷性診斷; 生物標記物

胰腺腫瘤(pancreatic cancer ,PC)為消化道發病率較高的惡性腫瘤，相較于其它類型腫瘤來說預后較差，是世界范圍內致死率排名第七的腫瘤[1]。盡管醫學技術取得了巨大的進步，但是對于胰腺癌的早期診斷和治療一直束手無策，胰腺癌患者的5年生存率仍然低于6%。2013年美國的調查報告中顯示46 420例(23 530例男性和22 890例女性)檢查出患有PC, 39 590例(20 170例男性和19 420例女性)死亡[2]。世界范圍內，在2012年約有338 000例檢查出患有胰腺癌[3]。由于胰腺在人體的位置較深，缺乏早期的檢查手段，且胰腺腫瘤惡性程度較高，一般的治療效果不理想，這些都是造成不良預后及生存期較短的主要原因[4-6]。由于影像學檢查和血清腫瘤標記物測定等非損傷性的診斷方法缺乏敏感性和特異性，病理組織檢查成為目前唯一可靠的診斷腫瘤類型及腫瘤分期的方法。但是病理活檢并不太適合胰腺癌高危人群早期的篩查及診斷,因此運用質子核磁共振(1HNMR)這種非損傷性的檢測方法[6]來進一步探索PC患者體內代謝物質的改變，尋找能有效應用于臨床胰腺癌早期診斷和篩查的檢測方法就顯得很有必要。

1 材料與方法

1.1 一般資料 病例來源于貴州醫科大學附屬醫院2012年1月至2013年12月通過影像及術后病理診斷已確診的胰腺癌患者14例作為腫瘤組，其中男性6例，女性8例；平均年齡(60.0±8.00)歲。所有患者在收集尿液之前未使用任何藥物及治療干預，取尿液儲存于-80 ℃冰箱內保存。11名正常健康人作為對照組，其中男性5名，女性6名；平均年齡(33.3±9.41)歲；尿液標本取自健康體檢者。入選者無免疫性疾病、腫瘤性疾病，近期無感染。腫瘤組與健康對照組之間在年齡、性別等方面具可比性(P>0.05)。

1.2 尿液樣品核磁共振分析 500 μL重水與50 μL 3-三甲基甲硅烷基-2, 2, 3, 3-四氘代丙酸鈉[3-trimethylsilyl-(2,2,3,3-2H4)-propionate, TSP]混勻后高速低溫離心，將100 μL樣品上清加入直徑5 mm的NMR玻璃樣品管。在Bruker DPX-600.13 MHz核磁共振儀上記錄尿液水相質子核磁共振譜。以TSP作為尿液樣品1HNMR譜化學位移的參照峰，設為0 ppm (δ0.0)。

1.3 NMR數據處理以及模式識別分析 利用Principle Component Analysis (PCA)進行分析。基于PC的得分圖(score plot)區分不同處理組別；基于PC的輸出載荷圖(loading plot)可判定95%的可信區間內的代謝物。

1.4 化學位移指認 將有差異的化學位移通過Human Metabolome Database (HDMB)查詢[7]。

1.5 統計學方法 應用SPSS 13.0統計學軟件，對計量資料進行比較，符合正態分布的采用Student'st檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

通過主成分分析法(PLS)分析尿液代謝小分子產物，用以區分兩組人群。在尿液1HNMR譜的得分圖中，胰腺腫瘤患者組與正常對照組能明顯的區分開。

PCA線圖分析獲得的VIP線圖(圖1)將胰腺癌患者與健康人群對照組尿液代謝物區含量高低分開，根據輸出線圖判定具有含量變化的區間，通過對區間的變化，找出具有差異的代謝產物。表見1。

表1 胰腺腫瘤患者與正常人群相比較代謝物質的變化

圖1 胰腺癌患者與健康人尿液代謝物線圖

3 討 論

胰腺因為受腫瘤細胞生長的影響而引起內外分泌功能的異常，出現人體能量、脂肪及氨基酸代謝狀態的改變，同時機體為適應腫瘤組織引起的代謝異常而又出現一定的代償，最終體現在機體組織、血液及尿液代謝組學成分上的改變。

胰腺腫瘤患者從尿液代謝組差異結果來看，主要出現機體糖代謝紊亂和脂肪酸的氧化能力降低，同時伴隨代謝分解狀態亢進、有氧呼吸和線粒體功能異常[8]及線粒體酶的損傷等，使得有氧氧化途徑“原料”堆積在血液中，造成物質代謝的異常。在我們的實驗研究中，β-葡萄糖、丙酮、硒代胱氨酸和乙酸鹽等含量明顯高于對照組，進一步說明胰腺腫瘤患者尿液中物質代謝與健康人存在明顯差異，發現這些異常增多的代謝物質，有助于今后進一步篩查出更特異的早期診斷胰腺腫瘤的代謝組學方法打下一定的研究基礎。

此外，可能因為局部生長的關系，特別是胰腺這種調整機體各種功能的重要器官因腫瘤細胞影響而導致機體內一些氨基酸代謝相關的酶發生代謝狀態改變而造成氨基酸的異常積聚。同時我們發現也有一些調控腫瘤細胞凋亡基因的氨基酸含量明顯增加，如谷氨酰胺/谷胱甘肽、1,3-丙二胺等，作為天然的抗氧化物中和細胞內氧自由基，在腫瘤的初始階段和發展過程中有著重要的作用，這可能與谷胱甘肽調控Jun N-terminal kinase (JNK)信號通路調控細胞的凋亡有關[9-10]。

近年來的研究表明，不同腫瘤的制備樣品的代謝圖譜與腫瘤的類型、增殖、代謝活性劑細胞凋亡具有相關性。通過對腫瘤代謝圖譜的研究，有助于人們了解腫瘤發生、發展以及致死的機制[11]，同時在臨床中可以作為非侵入性檢查手段，是臨床工作檢查策略的補充。我們的研究中也同樣存在一些不足，如所有患者均來自本省，病例數過少等。總之，HNMR代謝物的篩查，為臨床診斷工作提供一條有效的非侵入性的早期診斷胰腺腫瘤的方法。

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貴州省衛計委科學技術基金項目[gzwkj 2010-1-037]

R735.9

B

1000-744X(2016)02-0196-02

2015-05-21)

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