Th17細胞相關細胞因子在結直腸癌患者體內的分布及臨床意義

袁磊 吳雨崗 王勍 王海濤 錢光陽

(常州市第一人民醫院蘇州大學附屬第三學院胃腸外科，江蘇 常州 213000)

Th17細胞相關細胞因子在結直腸癌患者體內的分布及臨床意義

袁磊 吳雨崗△王勍 王海濤 錢光陽

(常州市第一人民醫院蘇州大學附屬第三學院胃腸外科，江蘇 常州 213000)

目的 探討結直腸癌(CRC)患者體內Th17細胞相關細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23的表達情況及其臨床意義。方法 選擇30例CRC患者和15名健康者為對照，采用實時熒光定量PCR法檢測腫瘤組織和正常瘤旁組織中細胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23 mRNA表達水平，ELISA法檢測外周血IL-17A、IL-23的水平；并作臨床相關性分析。結果 腫瘤組織標本中IL-17A的mRNA、IL-23的mRNA相對表達量高于對照組瘤旁組織中的mRNA相對表達量，差異皆有統計學意義(P<0.05)；IL-17F的 mRNA相對表達量低于對照組中的mRNA相對表達量，但兩者差異無統計學意義(P>0.05)；外周血IL-17、 IL-23水平均高于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。它們與患者的性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤發生部位均無關(P>0.05),而與有無淋巴結轉移及臨床分期有關(P<0.05)。結論 CRC 患者體內存在著細胞因子IL-17A、IL-23的高表達，提示Th17細胞可能參與了結直腸癌的發生發展。

結直腸癌； Th17細胞； IL-17; IL-23

結直腸癌(colorectal carcinoma, CRC)是全球范圍內困擾人類的常見惡性腫瘤之一，占腫瘤導致患者死亡人數的第三位[1]；尤其是在中國這樣的發展中的人口大國，CRC的患病率和死亡率一直高居不下,極大地摧殘著患者的生理和心理健康。相關研究發現，結直腸腫瘤發生的重要因素是感染和慢性炎性反應，其中炎性反應與腫瘤的發生發展及疾病的進程密切相關[2]。輔助性17細胞(Thl7)是新近發現的與自身免疫疾病、腫瘤、炎性反應和移植排斥反應相關的細胞群, Thl7細胞分泌的白細胞介素17(IL-17)和白細胞介素23(IL-23)等炎性細胞因子介導了上述過程的發展[3]。本研究通過檢測CRC患者腫瘤組織中和正常瘤旁組織Th17相關細胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23表達情況以及比較外周血中細胞因子IL-17、IL-23表達水平，分析它們與臨床各項指標的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

標本來源于2012年10月至2013年4月常州市第一人民醫院就診的30例CRC癌患者,其中直腸腺癌18例，結腸腺癌12例；男性21例，女性9例；平均年齡(65±3.20)歲。實驗組相關組織標本均取自手術，所有病例均經病理診斷證實。其中，腫瘤浸潤深度在黏膜及黏膜下層3例，固有肌層6例，漿膜及漿膜外21例；并淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移12例；遠處轉移6例。根據美國腫瘤聯合會(AJCC)大腸癌2010年pTNM分期標準進行分期：Ⅰ期4例，Ⅱ期8例，Ⅲ期12例，Ⅳ期6例，并分為早期組(Ⅰ期、Ⅱ期)和進展期組(Ⅲ、Ⅳ期)。對照組組織標本均為距腫瘤邊緣>10 cm且病理診斷驗證無腫瘤浸潤的正常瘤旁組織。術前l d清晨空腹抽取上述患者外周靜脈血3 mL；另收集15名健康者外周血標本作為對照。所有研究對象均無類風濕、紅斑狼瘡、慢性潰瘍性結腸炎等自身免疫性疾病史, 無免疫治療史, CRC患者術前均未接受過任何其它治療。

1.2 主要試劑

TRIzol○R試劑(Invitrogen by Life Technologies)，逆轉錄試劑盒(A3500，Promega Corporation)，實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR○RPremix Ex TaqTMⅡ，Perfect Real Time，Takara Bio，Inc.)；人IL-17 ELISA試劑盒(R&D Systems，Inc．) ，人IL-23 ELISA試劑盒(R&D Systems，Inc．) 。

1.3 方法

1.3.1 實時熒光定量PCR法檢測細胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表達水平 -70℃保存的CRC組織、正常瘤旁組織樣本稱取100 mg，在預冷的研缽中以液氮充分研磨組織，加入l mL Trizol溶液在玻璃勻漿器中徹底勻漿，室溫靜置30 min。將勻漿液移至1．5 mL 離心管中，室溫靜置5 min，按12 000 rpm，4 ℃離心5 min后吸取上清，提取總RNA 并逆轉錄為cDNA，采用SYBR green 染料法進行實時定量PCR 擴增目的基因。PCR 引物(由上海生工生物工程公司設計并合成)序列，IL-17A：正向引物5’-TTG ATT GGA AGA AAC AAC GAT GA-3’以及反向引物5’-CTC CAG GCT CAG CAG CAG TAg-3’；IL-17F：正向引物5’-GCC GCT CCA CCT CCCC-3’以及反向引物5’-AGA TGT CTT CCT TTC CTT GAG CA-3’；IL-23：正向引物 5’-GTG AGA TGT CAA GAA ACA GGC AAA-3’以及反向引物5’-AGT AAG GTG CCC TGT AGA GAT GGA-3’。PCR 反應條件：預變性95 ℃15 s；40 個循環，每個循環95 ℃ 5 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s。對PCR 產物熒光值以2△△CT方法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.3.2 ELISA法檢測外周血中細胞因子IL-17、IL-23水平 將所抽取的外周血標本按3 000 rpm離心10 min后吸取上清于-80℃保存待測，用雙抗夾心法分別檢測血清中細胞因子IL-17、IL-23水平。操作過程按ELISA試劑盒說明進行，細胞因子濃度用pg/mL表示。

2 結 果

2.1 兩組標本中細胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表達水平

實時熒光定量PCR 法檢測結果見表1。實驗組標本中IL-17A的mRNA相對表達量高于對照組，差異有統計學意義(P=0.042)；IL-17F的 mRNA相對表達量低于對照組，但兩者差異無統計學意義(P=0.538)；IL-23的mRNA相對表達量高于對照組，差異有統計學意義(P=0.047)。

表1 兩組標本中Th17細胞相關細胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表達水平

2.2 外周血標本細胞因子IL-17、IL-23的表達水平

ELISA法檢測外周血中細胞因子IL-17、IL-23水平的結果見表2。實驗組血清IL-17水平高于健康對照組(P=0.032)，IL-23水平高于對照組瘤旁組織培養液上清中的IL-23水平，兩組差異皆有統計學意義(P=0.008)。

表2 ELISA法檢測外周血IL-17、IL-23的水平

2.3 CRC患者體內Th17相關細胞因子和各項臨床資料指標的關系

收集CRC患者性別、年齡、腫瘤直徑、腫瘤發生部位，有無淋巴結和遠處轉移及臨床分期等相關臨床資料，分別分析上述兩種方法檢測的腫瘤組織中Th17細胞相關細胞因子表達水平與各項臨床資料的關系，結果顯示腫瘤組織中及血清標本中Th17相關細胞因子表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤發生部位均無關(P>0.05),而與有無淋巴結轉移及臨床分期有關(P<0.05),有淋巴結轉移者其腫瘤組織及血清中IL-17A、 IL-17F和IL-23表達水平高于無淋巴結轉移者，且進展期腫瘤組織及血清中細胞因子表達水平高于早期腫瘤組織。見表3、表4。

表3 腫瘤組織中細胞因子IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA相對表達量與臨床各指標關系

表4 外周血IL-17、IL-23表達水平和臨床各指標關系

3 討 論

CRC是大腸粘膜上皮在不良飲食因素、炎癥刺激或遺傳等多種致癌因素作用下發生的惡性病變，從最初的低度不典型增生腺瘤發展到高等級不典型增生腺瘤并最終轉化成癌，這個過程伴隨著腫瘤發生相關的基因突變積累和分子變化[4-5]。越來越多的證據表明， CD4+T細胞不同的淋巴細胞亞群之間的平衡和它們的細胞因子網絡是CRC發生發展的關鍵因素[6-7]，而其中尤以新近發現的Th17細胞備受矚目。Th17細胞同樣由初始T細胞分化而來，具有獨立的不同于Th1型和Th2型CD4+T細胞的分化及發育機制[8]，在許多自身免疫性疾病和慢性炎癥疾病中發揮重要免疫調節作用；而越來越多的研究發現，Th17細胞參與了多種腫瘤的發生發展[9-10]。

Th17細胞以表達IL-17而得名，這種新發現的促炎癥細胞因子包括6個家族成員—IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D(即IL-27)和IL-17E(即IL-25)、IL-17F[11]。Th17 細胞分泌的細胞因子IL-17及相關細胞因子，通過介導炎癥細胞從而發生炎性反應，而 IL-17A和IL-17F可以誘導表達多種趨化因子、促炎因子。IL-17的表達和多種自身免疫性疾病相關，其分化發育過程中受到了轉化生長因子-B(transforming growth factor beta，TGF-β)和IL-6以及IL-23、IL-21等細胞因子的調節[12]。IL-23同樣是一種十分重要的炎性介質，甚至被認為是腸道炎性反應的始動者，能引起炎性細胞因子級聯反應，致使腸道中IL-17、IL-6、IL-22表達水平增高，從而加劇炎性反應[13]；IL-23在Thl7細胞最初的分化過程中并不起作用，它作用于已經分化好的Thl7細胞，在維持Th17細胞的效應方面發揮重要作用，對促進Thl7細胞的存活與擴增是必須的[14]。雖然一致認為Th17細胞在腫瘤的發生發展中起著較為關鍵的作用，但其所起的作用及機制仍然存在很大爭議[15]。在CRC初發階段，Th17 細胞在腫瘤患者體內可能發揮促炎性反應的作用，起到了一定的抗瘤作用，但隨著腫瘤的進一步發生發展，患者機體免疫系統逐步失衡，相關炎性反應逐漸加劇，失控的炎性反應通過IL-6 活化細胞轉錄因子(如Star3)等途徑促進Th17 細胞的增殖分化和細胞因子IL-17、IL-23的分泌，它們繼而上調抗凋亡、促生長和促血管生成基因的表達，從而發揮了促瘤的作用[16-18]。

為了探討Th17細胞相關細胞因子在CRC患者外周血和腫瘤組織中的分布情況以及可能所起的作用，作者通過實時熒光定量PCR法檢測CRC患者腫瘤組織中與正常瘤旁組織中IL-17A、 IL-17F和IL-23的mRNA表達水平，結果顯示腫瘤組織中IL-17A和IL-23的mRNA水平均高于正常瘤旁組織，而IL-17F的mRNA水平在兩種組織中無差異，這一結果在細胞因子水平上表明，CRC患者腫瘤組織有利于Th17細胞維持活性效應和擴增，且有IL-17A的表達水平增高。同時，我們對它們和各項臨床資料指標的關系進行了分析，結果顯示Th17細胞相關細胞因子IL-17A和IL-23表達水平與腫瘤患者的性別、年齡、腫瘤大小及腫瘤發生部位無關，而與有無淋巴結轉移及臨床分期有關，暗示Th17細胞參與了CRC的免疫病理過程，而高濃度的IL-17A、 IL-23與CRC的預后密切相關。為了更進一步比較并驗證Th17細胞相關細胞因子在CRC患者體內相關組織的分布，本研究比較了CRC患者與健康對照組外周血IL-17和IL-23的表達水平。關于Th17細胞相關細胞因子在CRC患者外周血中升高早有報道，本資料中IL-17、IL-23的表達情況與Stanilov等的報道相一致，CRC患者血清中IL-17、IL-23水平明顯高于健康對照，并推測患者外周血細胞因子水平升高是由于腫瘤組織產生釋放入血而致。我們同樣分析了CRC患者外周血中IL-17、IL-23表達水平與各項臨床指標的關系，顯示IL-17、IL-23表達水平同樣只與CRC患者有無淋巴結轉移及臨床分期有關。

綜上所述，CRC患者腫瘤組織及外周血存在著IL-17、IL-23的高表達，提示腫瘤組織確實存在著利于Th17細胞活化擴增和維持效應的因素，其表達的相關細胞因子在CRC的發生發展中起著重要作用。因此，可以將它們作為重要的生物指標用于CRC的診斷與預后；而干預Th17細胞分泌相關細胞因子可能成為治療CRC的新策略。

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Distribution and clinical significance of Th17 cell-associa ted cytokines in colorectal cancer patient

YuanLei,WuYugang△,WangQing,WangHaitao,QianGuangyang.

DepartmentofGastrointestinalSurgery,TheThirdAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,TheFirstPeople'sHospitalofChangzhou,Changzhou213000,China.

Objective To explore the expression and clinical significance of Th17-related cytokines IL-17A, IL-17F, IL-23 in colorectal cancer patient (CRC). Methods A group of 50 patients and 15 healthy controls were included in the study. Real-time quantitative PCR was used to detect the expression levels of IL-17A, IL-17F, IL-23 and the quantitative determination of IL-23, IL-17 serum levels were performed by ELISA. The potential associations between them with the clinicopathological characteristics were analyzed. Results The IL-17A mRNA and IL-23 mRNA expression of tumor tissue samples were(0.02218±0.00549)and(0.00232±0.00478), significantly higher than those of healthy control (P<0.05)．The levels of serum IL-17 and IL-23 of CRC patients were significantly higher than those of the controls (16.39±1.72 vs 7.91±4.74 pg/ml, 68.12±11.22 vs 9.13±6.65 pg/ml (P< 0.05). The increased expression of IL-17A mRNA and IL-23 mRNA, also the levels of the serum IL-17 and IL-23 were not associated with the gender and age of patients with CRC, nor the umor size , tumor site (P>0.05), but associated with the lymph node metastasis and TNM stage (P< 0.05). Conclusion There was a significant increase of Th17 cell-associated cytokines in colorectal cancer patients, which suggests that IL-17 and IL-23 may directly or indirectly contribute to the development and progression of CRC.

Colorectal cancer； Th17； IL-17； IL-23

常州市科技支撐計劃基金資助項目[CE20125020]

R735.3

A

1000-744X(2016)02-0135-04

2015-12-04)

△通信作者,Email：wuyugang89@163.com