臍血干細胞移植對嚴重冠心病患者左心室重塑的改善作用

蔣智 賈中申,2 韋方,2△ 李安杰 周永剛 梁青龍 周松

(1.貴州省人民醫院心內科，貴州 貴陽，550002；2.貴州醫科大學，貴州 貴陽，550004)

·論 著·

臍血干細胞移植對嚴重冠心病患者左心室重塑的改善作用

蔣智1賈中申1,2韋方1,2△李安杰1周永剛1梁青龍1周松1

(1.貴州省人民醫院心內科，貴州 貴陽，550002；2.貴州醫科大學，貴州 貴陽，550004)

目的 研究異體臍帶血干細胞(UCBSC)移植對嚴重冠心病患者左心室重塑的作用。 方法 將40例冠狀動脈造影為三支血管彌漫病變的冠心病患者隨機分為對照組和UCBSC組，均給予常規內科藥物治療，UCBSC組在此基礎上經冠狀動脈前降支移植UCBSCs。移植前、移植后48 h、4周、12周分別檢測血清Ⅰ型前膠原羧基端肽(PICP)、Ⅲ型前膠原氨基末端前肽(PCⅢNP)和血管內皮生長因子(VEGF)水平，用心臟超聲檢測左室舒張末期內徑(LVEDd)、左室收縮末期內徑(LVESd)和左室射血分數(LVEF)值。結果 UCBSC組患者均未發現過敏反應及移植相關不良反應。與對照組及移植前相比，UCBSC組在移植后48 h血清VEGF水平顯著升高(P<0.01)，血漿PICP、PCⅢNP水平降低(P<0.01)，且VEGF變化與PICP、PCⅢNP呈負相關(P<0.01)。移植后12周，UCBSC組LVESd小于對照組(P<0.05)，但LVEF差異無統計學意義。結論 嚴重冠心病患者經冠脈移植異體UCBSCs安全有效，通過上調VEGF表達可抑制心臟纖維化，從而改善左室重塑。

冠心病； 臍帶血干細胞； 異體移植； 膠原； 心室重塑

冠心病已成為嚴重危害我國人民生命健康的疾病[1]。穩定型心絞痛患者冠狀動脈造影約有10%為三支血管病變，其中部分嚴重彌漫性病變患者介入或搭橋手術風險極高。心臟長期慢性缺血可引起心肌細胞間基質纖維化，導致心臟擴大、心功能不全，被稱為缺血性心肌病[2]。動物研究發現，臍帶血干細胞(umbilical cord blood stem cell，UCBSC)經靜脈移植可上調家兔心肌血管內皮生長因子(VEGF)的表達水平，從而促進血管新生[3]。VEGF不僅可促進內皮細胞增殖、遷移形成新生血管[4]，還與細胞外基質的膠原代謝密切相關[5]。我們推測UCBSCs移植治療缺血性心肌病可通過提高VEGF表達水平改善心室重塑，因此本研究納入嚴重彌漫性三支血管病變的冠心病患者，經冠狀動脈移植UCBSCs，觀察其對血漿血管內皮生長因子(VEGF)、Ⅰ型前膠原羧基端肽(PICP)、Ⅲ型前膠原氨基末端前肽(PCⅢNP)表達及左室大小和射血分數等指標的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2009年1月至2010年12月我科住院的冠心病患者40例，所有患者經冠狀動脈造影證實為三支血管彌漫性病變，均無介入手術及冠脈搭橋指征。男28例，女12例，年齡51～78歲，隨機分為對照組和UCBSC組，均給予常規內科藥物治療，UCBSC組在此基礎上通過冠狀動脈前降支移植UCBSCs。兩組年齡、性別、腎功能、合并高血壓、糖尿病及基礎心功能情況差異無統計學意義(表1)，均服用阿司匹林、ACEI或ARB、β-受體阻滯劑、他汀類、硝酸脂類和利尿劑等藥物，并排除嚴重肝腎功能不全、慢性阻塞性肺病、惡性腫瘤和血液系統疾病。該研究方案通過本院倫理委員會批準，所有患者均同意接受異體UCBSCs移植并簽署知情同意書。

表1 入選患者基本情況

1.2 人臍血單個核細胞的提取與制備

所有臍帶血均采自貴州省人民醫院婦產科無妊娠并發癥、身體健康、新生兒足月分娩(37～40周)的孕婦，均自愿捐獻，同意用于科學研究和臨床治療。用一次性血袋采集臍帶血80～120 mL，6 h內用1.077 g/L Ficoll密度梯度離心分離法分離，吸取中間單個核細胞層，反復PBS漂洗，220 μm濾網過濾去除細胞團塊，最后用20 mL肝素鹽水(20 U/mL)制成單個細胞懸液，30 min內用于移植，移植前臺盼藍染色計數活細胞。

1.3 臍血單個核細胞移植

患者取平臥位，常規消毒鋪巾，2%利多卡因局部麻醉。右橈動脈穿刺建鞘，通過指引導管經ATM導絲(泰爾茂，日本)將非快速交換球囊(over-the-wire，強生，美國)送至左前降支。退出鋼絲，4～6 atm充盈球囊，經球囊中央孔將UCBSCs單細胞懸液緩慢推注。全程監測心率、血壓、血氧飽和度。

1.4 血VEGF、PICP、PCIIINP檢測

UCBSCs移植前及移植后48 h、4周、12周取外周靜脈血6 mL(早晨空腹時采血,靜置30 min, 3 000 r離心10min,收集上清，-80 ℃保存)，檢測VEGF、PICP、PCIIINP濃度。VEGF試劑盒購自深圳晶美生物制品有限公司，PICP、PCⅢNP試劑盒購自大連泛邦化工技術開發有限公司，按照試劑盒說明書操作。

1.5 心臟超聲檢查

UCBSCs移植前及移植后48 h、4周、12周行經胸二維心臟超聲評估左室舒張末內徑(LVEDd)、左室收縮末內徑(LVESd)及左室射血分數(LVEF)。

1.6 統計學方法

檢測結果以均數±標準差(mean±SD)表示，用SPSS統計軟件分析數據。血清VEGF、PICP、PCⅢNP結果組內比較用配對t檢驗，組間比較用獨立樣本t檢驗，VEGF和PICP、PCIIINP用Pearson積矩相關系數(r)進行相關性分析，LVEDd、LVESd和LVEF用雙因素方差分析，P<0.05 示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 UCBSCs移植一般情況

UCBSC組每位患者接受移植的細胞總量為(5.23±2.47)×108，移植前細胞存活率為(96.1±2.3%)，移植后患者住院觀察48 h，之后隨訪12周，未發現過敏反應及移植相關不良反應。

2.2 血清VEGF、PICP和PCⅢNP水平的變化

對照組各時間點血清VEGF、PICP和PCⅢNP水平差異無統計學意義。與對照組及移植前比較，UCBSC組VEGF水平在移植后48 h顯著升高，而PICP和PCⅢNP水平明顯降低(表2)。移植后4周和12周，UCBSC組指標較移植前及與對照組比較差異無統計學意義。

表2 血清VEGF、PICP和PCⅢNP水平的變化

2.3 VEGF與PICP、PCⅢNP的關系

移植后48 h血清VEGF與PICP、PCⅢNP呈負相關(r=-0.696、-0.775,P<0.01)，說明UCBSCs移植上調VEGF表達的水平與抑制纖維蛋白合成的程度呈負相關。

2.3 心臟左室內徑及射血分數的變化

對照組LVEDd和LVESd值隨時間延長逐漸增加(P<0.01)，EF值逐漸降低(P<0.01)，提示慢性缺血引起左室重塑、心功能降低。與對照組比較，盡管UCBSC組移植后12周的LVEDd和LVEF值差異無統計學意義，但LVESd小于對照組(P<0.05)，提示UCBSCs移植改善了心室重塑。

表3 不同時間點兩組患者左室直徑及射血分數變化

注：與同時間點對照組比較，*P<0.05。

3 討 論

3.1 異體干細胞移植策略的價值

干細胞移植通過“旁分泌效應”促進受損心臟修復具有巨大的潛力[2-6]。已報道的臨床試驗大多移植自體干細胞[7]，雖然避免了免疫排斥反應，但存在以下不足：首先，每個患者都要獲取自身靶細胞并體外培養增殖，可能錯過疾病治療最佳時間窗；其次，缺血性心肌病患者通常合并高齡、糖尿病、高血壓、高脂血癥等多種伴隨疾病，嚴重削弱自體干細胞的治療潛力[8]。因此，學術界提出異體干細胞移植策略，即儲備年輕健康人群來源的高質量干細胞以“現貨”形式供給臨床使用，可節省大量人力物力，有利于擴大干細胞治療的規模從而使更多患者受益[9]。UCBSCs來源豐富，具備取材方便、免疫原性低、有多向分化潛能等優點，是近年來倍受矚目的理想“現貨”種子細胞之一[10]，現已建立起大型UCBSCs庫。免疫排斥反應是異體移植最大的風險，我們在患者UCBSCs移植后住院觀察48 h，每月隨訪，均未發現明顯過敏反應或移植相關不良反應。

3.2 UCBSCs移植改善心室重塑

心臟基質主要成分是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，在心室重塑過程中，心臟膠原總量增加，Ⅰ型膠原含量增加，Ⅲ型膠原含量減少，Ⅰ/Ⅲ型膠原比值升高[11]。血清PICP和PCⅢNP水平能較好地反映心肌間質Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成水平，是反映心臟纖維化活動程度的指標[12]。有文獻[13]報道VEGF表達水平與肝臟纖維化程度呈正相關，但我們的前期研究[14-15]發現經冠狀靜脈竇逆行灌注VEGF蛋白可改善內皮功能，促進心肌梗死區血管新生，抑制心室重塑，減少心肌梗死面積，改善左室功能。這說明VEGF在不同臟器纖維化進程中的作用不同：在肝纖維化中VEGF可能促進內皮細胞增殖形成假小葉加重纖維化；而在心肌纖維化中VEGF可能促進血管新生改善心肌灌注從而抑制纖維化。本研究發現，HCBSCs移植后48 h可明顯降低血漿PICP和PCⅢNP水平，且下降程度與VEGF升高程度呈負相關，提示HCBSCs通過上調VEGF的表達可抑制心肌間質Ⅰ、Ⅲ型膠原合成。移植后4周 UCBSC組患者血清VEGF、PICP和PCⅢNP即恢復到移植前水平，故我們認為UCBSCs移植早期已通過促進血管新生減輕基質纖維化，并且除上調VEGF表達外UCBSCs還可能通過其它機制改善心室重塑。移植后12周UCBSC組患者LVESd值明顯低于對照組，進一步說明UCBSCs移植改善了心室重塑。至于12周時兩組患者LVEF差異無統計學意義，我們認為一方面可能因為入選例數不足，觀察時間過短，不足以顯示UCBSCs移植的效應；另一方面，因缺血性心肌病患者心臟擴大、室壁運動不協調，評估心臟腔室大小存在誤差[16]，導致數據離散度較大。這些問題有待在今后的研究設計中進一步改進。

總之，嚴重冠心病患者經冠狀動脈移植異體UCBSCs安全有效，UCBSCs移植可通過上調VEGF表達水平抑制心臟纖維化并改善左室重塑。UCBSCs作為“現貨”干細胞產品治療冠心病具有誘人的發展前景。

[1] 陳偉偉, 高潤霖, 劉力生, 等. 《中國心血管病報告2014》概要 [J]. 中國循環雜志， 2015 (07): 617-622.

[2] Kelkar AA, Butler J, Schelbert EB, et al. Mechanisms Contributing to the Progression of Ischemic and Nonischemic Dilated Cardiomyopathy: Possible Modulating Effects of Paracrine Activities of Stem Cells [J]. J Am Coll Cardiol, 2015, 66 (18): 2038-2047.

[3] 潘瑋, 周波, 汪弢, 等. 靜脈移植人臍血細胞促進家兔急性心肌梗死血管再生 [J]. 基礎醫學與臨床，2010(12):1313-1317.

[4] Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors [J]. Nat Med, 2003, 9 (6): 669-676.

[5] Zhao T, Zhao W, Meng W, et al. Vascular endothelial growth factor-C: its unrevealed role in fibrogenesis [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2014, 306 (6): H789-H796.

[6] Fisher SA, Brunskill SJ, Doree C, et al. Stem cell therapy for chronic ischaemic heart disease and congestive heart failure [J]. Cochrane Database Syst Rev, 2014, 4: CD007888.

[7] Cong XQ, Li Y, Zhao X, et al. Short-Term Effect of Autologous Bone Marrow Stem Cells to Treat Acute Myocardial Infarction: A Meta-Analysis of Randomized Controlled Clinical Trials [J]. J Cardiovasc Transl Res, 2015, 8 (4): 221-231.

[8] Zhuo Y, Li SH, Chen MS, et al. Aging impairs the angiogenic response to ischemic injury and the activity of implanted cells: combined consequences for cell therapy in older recipients [J]. J Thorac Cardiovasc Surg, 2010, 139 (5): 1286-1294, 1294, 1281-1282.

[9] Vonk LA, de Windt TS, Slaper-Cortenbach IC, et al. Autologous, allogeneic, induced pluripotent stem cell or a combination stem cell therapy? Where are we headed in cartilage repair and why: a concise review [J]. Stem Cell Res Ther, 2015, 6: 94.

[10] Copeland N, Harris D, Gaballa MA. Human umbilical cord blood stem cells, myocardial infarction and stroke [J]. Clin Med, 2009, 9 (4): 342-345.

[11] De Haas HJ, Arbustini E, Fuster V, et al. Molecular imaging of the cardiac extracellular matrix [J]. Circ Res, 2014, 114 (5): 903-915.

[12] 張曉麗, 吳強, 彭林林, 等. 心肌梗死后心臟膠原重塑與心功能的變化 [J]. 貴州醫藥，2008 (06): 487-489.

[13] 李曉虹, 楊蒲芳, 戚紅霞, 等. 血清TGF-β1及VEGF在慢性乙肝、肝纖維化、肝硬化患者的臨床變化及其意義 [J]. 臨床消化病雜志，2011 (03): 144-145.

[14] 韋方, 袁明蘭, 周永剛, 等. 冠狀靜脈竇逆行灌注VEGF蛋白的實驗研究 [J]. 貴州醫藥， 2008 (06): 499-500.

[15] 韋方, 袁明蘭, 周永剛, 等. 冠狀靜脈竇逆行灌注VEGF對心肌梗死兔心功能及心肌梗死面積的影響 [J]. 中國病理生理雜志， 2009 (03): 597-600.

[16] 萬林林, 吳文芳, 方玲玲, 等. 實時三維超聲心動圖評價心肌梗死患者左室收縮功能的研究 [J]. 臨床超聲醫學雜志， 2015 (06): 375-378.

Transplantation of umbilicalcord blood stem cell attenuated left ventricular remodeling in severe coronary artery disease patients

JiangZhi1,JiaZhongshen1,2,WeiFang1,2,LiAnjie1,ZhouYonggang1,LiangQinglong1,ZhouSong1.

1.DepartmentofCardiology,GuizhouProvincialPeople'sHospital,Guiyang550002,China. 2.GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China.

Objective To investigate the effect of intra-coronary transplantation of allogeneic umbilical cord blood stem cells (UCBSC) on left ventricular remodeling in severe coronary artery disease patients. Methods 40 diffused 3-vessel disease patients were randomly divided into control and UCBSC group. Both groups were administrated with routine medications and UCBSC group was transplanted with UCBSCs through left descending artery. Serum vascular endothelial growth factor (VEGF), carboxy terminal propeptide of procollagen type I (PICP), precollagen type Ⅲ N-peptide (PCIIINP) was measured before, 48 hours, 4 weeks and 12 weeks after UCBSCs transplantation. Left ventricular end diastolic diameter (LVEDd), left ventricular end systolic diameter (LVESd) and left ventricular ejection fraction (LVEF) were evaluated with 2-D echocardiography. Results All patients in UCBSC group did not show any allergic reaction or transplantation related adverse effect. As compared with pre-transplantation and the same timepoint of control group, serum VEGF concentration increased in UCBSC group at 48 h (P<0.01), however, PICP and PCIIINP concentrations decreased (P<0.01). The VEGF and the PICP or PCIIINP showed negative correlation (P<0.01). The LVESd were larger in control group than that in UCBSC group at 12 weeks (P<0.05), but the difference of LVEDd and LVEF showed no significance. Conclusion It is safe and effective that allogeneic UCBSCs transplantation upregulated VEGF expression,reduced myocardial fibrosis and attenuated left ventricular remodeling in severe coronary artery disease patients.

Coronary artery disease； Umbilical cord blood stem cell Allogeneic transplantation; Collagen Remodeling

國家自然科學基金地區科學基金[81460050]，貴州省科技廳貴州省人民醫院聯合基金[黔科合LS字(2011)014]，貴州省科技廳科學技術基金[黔科合J字(2014)2112號]，貴州省衛計委科學技術基金[gzwkj2013-1-006]

R-33；R542.2

A

1000-744X(2016)02-0115-04

2015-11-05)

△通信作者，E-mail：w13639087323@qq.com