肝癌組織中LUZP表達變化及其與患者臨床病理特征的關系

Ali Faheem，李光兵，劉軍

(山東大學附屬省立醫院，濟南250021)

肝癌組織中LUZP表達變化及其與患者臨床病理特征的關系

Ali Faheem，李光兵，劉軍

(山東大學附屬省立醫院，濟南250021)

目的 探討亮氨酸拉鏈蛋白(LUZP)表達與肝癌患者臨床病理特征的關系。方法 選擇接受手術治療的77例肝癌患者的肝癌及癌旁肝組織，采用實時定量PCR法檢測癌及癌旁肝組織中LUZP mRNA的表達，采用免疫組化法檢測癌及癌旁肝組織中LUZP蛋白的表達，半定量計分法對免疫組化結果進行統計分析。以癌旁肝組織LUZP mRNA均值為標準，將肝癌患者分為LUZP 高表達、低表達兩個水平，比較不同LUZP表達水平患者的臨床病理特征。結果 肝癌與癌旁肝組織LUZP mRNA表達分別為1.87±0.11、0.58±0.05，肝癌組織中LUZP mRNA表達高于癌旁肝組織(P<0.05)。肝癌與癌旁肝組織LUZP蛋白表達分別為(10.0±1.5)、(4.0±0.5)分，肝癌組織中LUZP蛋白表達高于癌旁肝組織(P<0.05)。以癌旁肝組織LUZP mRNA均值為標準，將肝癌患者分為LUZP 高表達49例、低表達28例。LUZP高表達患者侵犯門靜脈、TNM 1+2期、復發的發生率均高于低表達患者(P均<0.05)。低表達患者的總生存時間是36個月，高表達患者的總生存時間是12個月，LUZP高表達患者的生存時間低于低表達患者(P<0.05，OR=1.88, 95%CI為1.08～3.30)。結論 LUZP是肝癌患者預后的生物學指標，其高表達提示肝癌患者預后差。

肝細胞癌；亮氨酸拉鏈蛋白；預后

肝癌是發病率第五位的惡性腫瘤，是世界上第三位的導致癌癥相關死亡的疾病[1]。目前手術是治療肝癌惟一的治愈方法。但是多數肝癌患者就診時已處于腫瘤晚期，手術治療后腫瘤的轉移和復發易導致手術治療效果差[2]。降低肝癌術后復發率、提高患者預后是目前肝癌治療領域的主要難點之一。亮氨酸拉鏈蛋白(LUZP)是一種含有亮氨酸拉鏈基序的蛋白質[3]，在正常發育中起到重要的調控作用，其表達缺失將導致胚胎出顱神經管的閉合缺損[4]。研究發現，LUZP的異常表達與多種腫瘤的發生密切相關，在乳腺癌、腎癌、宮頸癌和胰腺癌等腫瘤組織中均檢測到LUZP的過度表達，且其表達與患者預后相關[5～7]。目前對肝癌組織中LUZP的表達情況尚不明確。我們選擇2010年9月～2012年1月行手術治療的77例肝癌患者，對其癌組織中LUZP的表達情況進行檢測，探討LUZP的表達與患者臨床病理特征的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期在我院接受手術治療的77例肝癌患者的肝癌及癌旁肝組織，男67例、女10例，年齡24～73歲、中位年齡48.5歲。均經病理學檢查確診。均無丙型肝炎病毒感染和黃曲霉素接觸史。收集患者臨床病理特征數據，包括年齡、性別、甲胎蛋白水平、腫瘤大小、門靜脈侵犯、淋巴結轉移、酒精攝入量、肝癌TNM分期、肝癌家族史、復發、乙肝病毒感染狀況、丙肝病毒感染情況、黃曲霉毒素接觸史和生存時間。

1.2 LUZP mRNA表達檢測 將癌及癌旁肝組織分割后液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。應用Allprep DNA/RNA抽提試劑盒提取組織總RNA，應用去DNA試劑盒去除RNA標本中的基因組DNA。ND-2000超微量分光光度計測定RNA濃度。取1 μg總RNA為模板，應用cDNA逆轉錄試劑盒合成cDNA。采用實時定量PCR法檢測癌及癌旁肝組織中LUZP mRNA的表達。引物序列：LUZP 正向5′-CGGAAGTATTGACGGAAAGC-3′，反向5′-GCTTGTAAATTCG-GCCATGT-3′，產物長度237 bp；β-Actin正向5′-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3′，反向5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′。qPCR反應條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s 40個循環。用2%瓊脂糖凝膠對擴增的產物進行電泳分離并用EB染色。以2-ΔΔCt法分析結果。

1.3 LUZP蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取癌及癌旁肝組織制備石蠟切片，脫蠟后梯度酒精水化，0.1 mmol/L枸櫞酸鈉行抗原修復。利用兔抗人LUZP多克隆抗體一抗孵育切片，應用辣根過氧化物酶偶聯的鼠抗兔二抗進行顯影。顯微鏡下計數陽性染色細胞數。半定量法評分法對LUZP陽性率進行分析。染色強度評分為：1分為無陽性染色；2分為無陽性染色；3分為中度陽性染色；4分為強陽性染色。陽性細胞百分比評分：0分為無陽性細胞；1分為陽性細胞數<10%；2分為陽性細胞數10%～50%；3分為陽性細胞數51%～80%；4分為陽性細胞數>80%。以染色強度評分與百分比評分乘積計為半定量評分分數。

1.4 隨訪方法 所有患者隨訪至死亡或隨訪至2016年6月，記錄生存時間。

2 結果

2.1 肝癌與癌旁肝組織中LUZPmRNA表達比較 肝癌與癌旁肝組織LUZPmRNA表達分別為1.87±0.11、0.58±0.05，肝癌組織中LUZPmRNA表達高于癌旁肝組織(P<0.05)。以癌旁肝組織LUZPmRNA均值為標準，將肝癌患者分為LUZP高表達49例、低表達28例。

2.2 肝癌與癌旁肝組織中LUZP蛋白表達比較 免疫組化法對肝癌與癌旁肝組織中LUZP蛋白進行檢測，半定量法進行統計分析。結果顯示，肝癌與癌旁肝組織中LUZP蛋白表達分別為(10.0±1.5)、(4.0±0.5)分，肝癌組織中LUZP蛋白表達高于癌旁肝組織(P<0.05)。

2.3LUZPmRNA表達與臨床病理特征的關系LUZP高表達患者侵犯門靜脈、TNM1+2期、復發的發生率均高于低表達患者(P均<0.05)。LUZP高表達與低表達患者在年齡、性別、淋巴結轉移、乙肝病毒感染、甲胎蛋白水平、腫瘤直徑、腫瘤史和酒精攝入量方面無統計學差異。見表1。

2.4LUZPmRNA水平與肝癌患者預后相關性 所有患者均隨訪至患者死亡或2016年6月，所有死亡患者死亡原因均為肝癌復發。低表達患者的總生存時間是36個月，高表達患者的總生存時間是12個月，LUZP高表達患者的生存時間低于低表達患者(P均<0.05，OR=1.88, 95% CI為1.08～3.30)。

表1 不同LUZP表達水平患者的臨床病理特征(例)

3 討論

肝癌是在慢性肝臟疾病如慢性肝炎、酒精性肝炎等基礎上發展而來的[8,9]，乙肝病毒、丙肝病毒感染等肝癌發病的危險因素會誘導原癌基因過度活化或抑癌基因失活，從而導致肝癌的發生、發展[10]。肝癌發病隱匿、進展迅速，70%～80%病例發現時已處于中晚期，如合并門靜脈癌栓、肝外轉移等，若不進行有效干預，患者短期內可能出現死亡。手術是目前治療肝癌最有效的手段[11]。但手術治療后腫瘤復發率高，肝癌患者術后的5年生存率低于20%[12]。研究與肝癌復發相關的生物學標志物,有助于制定合理的治療方案、改善患者預后、提高患者生存時間。

LUZP是一種調節蛋白，含有一個20種氨基酸的片段，富含有氨基酸殘基的堿基端拉鏈基序的側邊區域、包括堿性區域、亮氨酸殘基的周期排列被稱為“堿性亮氨酸拉鏈基序”或亞模體(亞超二級結構)[13]。這個堿性區域被認為是通過與帶負電荷的磷酸基團的DNA相互作用來促進DNA間的結合，參與基因表達的調控。LUZP過度表達或突變都可能導致惡性腫瘤的發生，在宮頸癌、乳腺癌、胰腺癌等實體腫瘤中均可檢測到LUZP的異常表達[5, 7]。本研究發現，肝癌組織中LUZP mRNA及蛋白表達均高于癌旁肝組織，提示LUZP的異常表達可能上調癌基因或下調抑癌基因的表達，誘導肝癌的發生、發展。本研究結果同樣發現，LUZP高表達患者的生存時間低于低表達患者，提示LUZP mRNA高表達預示著患者生存時間短。

文獻報道，胰腺癌、乳腺癌和宮頸癌患者LUZP的過度表達提示患者預后不良[13]。LUZP表達升高能夠抑制胰腺癌細胞的凋亡，降低胰腺癌細胞對放射治療的敏感性，降低胰腺癌患者5年生存率[14]。Jang等[5]研究顯示，LUZP表達升高會促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移能力，高表達LUZP的乳腺癌患者治療后容易出現復發和轉移，導致患者長期生存率顯著下降。Kang等[15]研究發現，LUZP表達升高同樣能夠促進宮頸癌細胞的侵襲和轉移能力，降低患者預后。本研究發現，在門靜脈侵犯率、腫瘤分期以及復發率方面，LUZP mRNA高表達組與低表達組患者存在顯著差異，高表達組患者在診斷時更多處于腫瘤晚期、合并門靜脈侵犯，治療后復發率顯著高于低表達組患者，這與高表達組患者預后比低表達組患者差的結果一致，也提示LUZP的異常高表達能夠促進腫瘤的進展。

本研究發現，LUZP mRNA高表達組與低表達組患者在淋巴轉移、腫瘤直徑以及甲胎蛋白水平方面差異無統計學意義。文獻研究顯示，甲胎蛋白水平與肝癌患者預后相關，甲胎蛋白水平升高提示患者預后差。而大肝癌或巨大肝癌患者預后比小肝癌患者預后差。本研究結果未能證實LUZP表達與腫瘤大小以及甲胎蛋白水平間的相關性，可能與本研究樣本量小有關，因此需擴大樣本量進行進一步的研究。

綜上所述，LUZP在肝癌組織中的表達顯著高于癌旁肝組織，提示其異常高表達會促進肝癌的發生、發展,其表達升高提示肝癌患者預后差。本研究結果為LUZP作為肝癌預后的生物學指標以及作為肝癌治療靶點蛋白提供了實驗依據。

[1] Liu Y, Pan S, Liu L, et al. A genetic variant in long non-coding RNA HULC contributes to risk of HBV-related hepatocellular carcinoma in a Chinese population [J]. PloS One, 2012,7(4):e35145.

[2] Kishi Y, Hasegawa K, Sugawara Y, et al. Hepatocellular carcinoma: current management and future development-improved outcomes with surgical resection [J]. Inter J Hepatol, 2011,2011:728103.

[3] Meissner C S, Suffner S, Schauflinger M, et al. A leucine zipper motif of a tegument protein triggers final envelopment of human cytomegalovirus [J]. J Virol, 2012,86(6):3370-3382.

[4] Chen Y, Zhou Y, Qiu S, et al. Autoantibodies to tumor-associated antigens combined with abnormal alpha-fetoprotein enhance immunodiagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Letters, 2010,289(1):32-39.

[5] Jang SY, Jang SW, Ko J. Regulation of ADP-ribosylation factor 4 expression by small leucine zipper protein and involvement in breast cancer cell migration [J]. Cancer Letters, 2012,314(2):185-197.

[6] Peng Y, Clark C, Luong R, et al. The leucine zipper putative tumor suppressor 2 protein LZTS2 regulates kidney development [J]. J Bio Chem, 2011,286(46):40331-40342.

[7] Kang H, Jang SW, Ko J. Human leucine zipper protein sLZIP induces migration and invasion of cervical cancer cells via expression of matrix metalloproteinase-9 [J]. J Bio Chem, 2011,286(49):42072-42081.

[8] Venook AP, Papandreou C, Furuse J, et al. The incidence and epidemiology of hepatocellular carcinoma: a global and regional perspective [J]. Oncologist, 2010,15(Suppl 4)：5-13.

[9] Staib F, Hussain SP, Hofseth LJ, et al. TP53 and liver carcinogenesis [J]. Human Mut, 2003,21(3):201-216.

[10] Aravalli RN, Steer CJ, Cressman EN. Molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma [J]. Hepatology, 2008,48(6):2047-2063.

[11] Li GB, Zhang XL, Yuan L, et al. Protein phosphatase magnesium-dependent 1delta (PPM1D) mRNA expression is a prognosis marker for hepatocellular carcinoma [J]. PloS One, 2013,8(3):e60775.

[12] Liu X, Wang S, Xia X, et al. Synergistic role between p53 and JWA: prognostic and predictive biomarkers in gastric cancer [J]. PloS One, 2012,7(12):e52348.

[13] Hussain SP, Schwank J, Staib F, et al. TP53 mutations and hepatocellular carcinoma: insights into the etiology and pathogenesis of liver cancer [J]. Oncogene, 2007,26(15):2166-2176.

[14] Nagasaki K, Schem C, Von Kaisenberg C, et al. Leucine-zipper protein, LDOC1, inhibits NF-kappaB activation and sensitizes pancreatic cancer cells to apoptosis [J]. Inter J Cancer, 2003,105(4):454-458.

[15] Xu H, Dhanasekaran DN, Lee CM, et al. Regulation of neurite outgrowth by interactions between the scaffolding protein, JNK-associated leucine zipper protein, and neuronal growth-associated protein superior cervical ganglia clone 10[J]. J Bio Chem, 2010,285(6):3548-3553.

劉軍(E-mail: Dr_liujun1967@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.018

R735.7

B

1002-266X(2016)46-0062-03

2016-05-21)