順鉑腎損害大鼠三七總皂苷干預前后尿液的核磁共振代謝組學分析

黃振光，楊玉芳，鄒小琴，黃春，周金玲

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

·論著·

順鉑腎損害大鼠三七總皂苷干預前后尿液的核磁共振代謝組學分析

黃振光，楊玉芳，鄒小琴，黃春，周金玲

(廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧530021)

目的 應用核磁共振(NMR)代謝組學方法，分析三七總皂苷(PNS)干預順鉑腎損害大鼠前后的尿液代謝物變化，為研究PNS防治順鉑腎損害的機制提供依據。方法 選擇雄性SD大鼠45只，分為正常對照組、順鉑組及PNS組各15只。順鉑組、PNS組第1天先給予腹腔注射單劑量順鉑5 mg/kg制備順鉑腎損害模型。PNS組第1天腹腔注射單劑量順鉑后再給予腹腔注射PNS 31.35 mg/kg，第2～8天繼續腹腔注射PNS 31.35 mg/kg。正常對照組第1～8天予腹腔注射生理鹽水31.35 mg/kg。應用NMR代謝組學方法，取各組第1、4、8天的尿液標本500 μL，離心后取上清500 μL置于核磁管中，使用Varian 600磁譜儀檢測尿液，得到NMR圖譜。對歸一化后的NMR圖譜數據采用SIMCA-P+軟件進行模式識別多變量分析，采用中心化換算的數據標度換算方式進行主成分分析(PCA)，采用自適換算的數據標度換算方式進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，采用正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)對PLS-DA 模型進行正交校正處理。通過對OPLS-DA的分析以及通過分析各代謝物相應的相關系數，篩選有統計學意義的差異代謝物。根據差異代謝物的KEGG數據庫ID在KEGG數據庫中進行映射，得到差異性代謝物的代謝通路。結果 正常對照組、順鉑組和PNS組的尿液NMR圖譜包含有一系列的代謝物，包括乙酰乙酸、丙酮、甲酸、檸檬酸、葡萄糖等。PCA、PLS-DA和OPLS-DA等多元分析顯示，第1、4和8天，順鉑組、PNS組均與正常對照組有顯著差異，而順鉑組與PNS組之間有部分重疊。第8天，順鉑組β-葡萄糖、α-葡萄糖、麥芽糖和乙醇胺低表達，而丙酮酸、琥珀酸和α-酮戊二酸高表達；與順鉑組比較，PNS組β-葡萄糖、α-葡萄糖、麥芽糖和乙醇胺高表達，而丙酮酸、琥珀酸和α-酮戊二酸低表達，PNS將表達異常的代謝物回調。各組間的尿液差異代謝物涉及氨基酸的生物合成、檸檬酸循環、糖酵解/糖異生途徑、戊糖磷酸途徑、甘油磷脂代謝、丙酮酸代謝、酮體合成和降解、苯丙氨酸代謝等代謝通路。結論 順鉑腎損害大鼠尿液中的代謝物發生改變，PNS可改善其中部分代謝物的變化，涉及能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝和脂肪代謝等多個通路，可能是PNS對順鉑腎損害大鼠發揮防治作用的機制之一。

三七總皂苷；順鉑；腎損害；核磁共振；差異代謝物；尿液；代謝組學

順鉑是治療各種惡性腫瘤尤其是實體瘤的首選藥物之一，但順鉑的腎毒性嚴重影響其在臨床上的應用。目前，順鉑誘導腎損害的分子機制尚未闡明，臨床尚缺乏防治順鉑腎損害的有效措施。研究發現，順鉑誘導腎損害可能涉及多種機制，如DNA損傷、炎癥反應、氧化應激[1]、細胞凋亡等[2]。三七總皂苷(PNS)提取自傳統中草藥三七，具有抗凋亡[3]、改善免疫功能和增強順鉑抗腫瘤的作用[4]，對腎臟疾病具有保護作用[5,6]。研究發現，PNS可降低順鉑誘導的血清Scr和BUN水平[7]，其保護順鉑腎損害作用可能與其降低氧化損傷有關[8]。目前，PNS保護順鉑腎損害的分子機制尚未明確，PNS干預后的尿液代謝物變化情況尚不明確。高通量技術是一類可快速檢測和處理大量樣本和信息的技術，具有信息量大、敏感性高、可自動化分析復雜多因素等優勢，可從整體水平上較全面、完整地闡述腎損害發生、發展的機制。因此，采用高通量技術研究順鉑腎損害的分子機制，有助于對順鉑腎損害可能涉及的多種通路進行研究。核磁共振圖譜法(NMR)是代謝組學的一種技術，是基于具有自旋性質的原子核在核外磁場作用下，吸收射頻輻射而產生能級躍遷的一種譜學技術。NMR以高通量檢測和數據處理為手段，可系統地研究生物標本中的代謝產物，用以探討藥物毒性或治療作用及其機制，已廣泛用于疾病診斷和進展預測、藥物治療作用及其機制的研究等[9]。2013年9月～2014年12月，我們采用NMR代謝組學方法，分析PNS干預順鉑腎損害大鼠后的尿液代謝物變化，為研究PNS防治順鉑腎損害的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 雄性SD大鼠15只，體質量(200±20)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，經廣西醫科大學動物倫理委員會批準。順鉑粉針劑購自齊魯制藥有限公司；三七總皂苷粉針劑購自廣西梧州制藥(集團)股份有限公司；尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)、β-N-乙酰胺基葡萄糖苷酶(NAG)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；氘代氯仿(CDCl3)、重水(D2O)、三甲基硅基丙酸鈉(TSP)購自Cambridge Isotope Laboratories公司(USA)。核磁共振光譜儀Varian 600型 (An INOVA，600 MHz)為美國 Varian INOVA公司產品；核磁共振管為美國Wilmad-Labglass公司產品。

1.2 動物分組、模型制備及干預方法 SD大鼠隨機分為正常對照組、順鉑組及PNS組，每組各45只。均自由進食、飲水，適應性飼養1周。順鉑、PNS給藥劑量參照成人臨床常用劑量換算標準及本課題組前期研究結果[10]確定。順鉑組第1天先給予腹腔注射單劑量順鉑5 mg/kg，再腹腔注射生理鹽水31.35 mg/kg，第2～8天繼續腹腔注射生理鹽水31.35 mg/kg，制備順鉑腎損害模型。PNS組第1天先給予腹腔注射單劑量順鉑5 mg/kg，再給予腹腔注射PNS 31.35 mg/kg，第2～8天繼續腹腔注射PNS 31.35 mg/kg。正常對照組第1～8天予腹腔注射生理鹽水31.35 mg/kg。各組腹腔注射均為1次/d?；诒菊n題組前期研究數據[3]，各組腹腔注射后第1、4、8天順鉑組血清Cr、BUN水平和尿液N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)水平升高，腎組織病理檢查示腎組織損傷明顯，證實順鉑腎損害的大鼠模型制作成功；PNS組血清Cr、BUN水平和尿液NAG水平較順鉑組下降，腎組織損傷明顯改善，證實PNS對其有一定保護作用。

1.3 尿液NMR圖譜數據采集 取各組第1、4、8天的尿液標本500 μL，置于1.5 mL離心管中，加入100 μL的1 000 mmol/L PB溶液，渦旋混勻，室溫放置5 min后，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清500 μL置于核磁管中檢測。使用Varian 600磁譜儀檢測尿液，1H共振頻率為599.91 Hz，橫向弛豫加權采用NOESY序列，弛豫延遲2 s，采集時間1.113 6 s，譜寬7 183.9 Hz，溫度25 ℃，得到NMR圖譜。

1.4 尿液NMR圖譜數據處理 所有NMR圖譜均采用MestReNova軟件(V7.1)進行傅立葉變換、相位調整、基線校正和定標等歸一化處理。為提高信噪比，圖譜在進行傅立葉變換時均乘以增寬因子為1 Hz的指數窗函數。對于尿液CPMG脈沖序列數據，積分區間設為0.5～9.5 ppm，積分間距設為0.005 ppm，同時去除區間6.60～4.22 ppm的尿素峰和水峰。

1.5 尿液NMR圖譜數據多變量分析 對歸一化后的圖譜數據采用SIMCA-P+軟件進行模式識別多變量分析。采用中心化換算的數據標度換算方式進行主成分分析(PCA)，采用自適換算的數據標度換算方式進行偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，采用12折交叉驗證法對模型的質量進行驗證，并用驗證得到的模型可解釋變量(R2X、R2Y)和可預測度(Q2)評判模型的有效性。以解釋模型的變異和預測能力的模型參數R2和Q2顯著升高(R2及Q2均>0.5)，表明是優秀的模型。采用正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)對PLS-DA 模型進行正交校正處理，并使用自適換算的數據標度換算方式。

1.6 尿液差異代謝物的篩選與鑒定 通過對OPLS-DA的分析以及通過分析各代謝物相應的相關系數，對有統計學意義的代謝物進一步歸納。在相關系數圖中，將每一個變量的載荷值與其標準偏差的平方根值相乘，然后進行數據的回溯轉換，并與相應的相關系數臨界值表進行比對，以相關系數r的絕對值>0.553認為是有意義的差異物，得到差異代謝物。根據差異代謝物的KEGG數據庫ID在KEGG數據庫中進行映射，整理出代謝物映射到的所有代謝通路，將代謝物按通路分類，整理出某一通路中所有的差異代謝物。

2 結果

2.1 各組尿液NMR圖譜分析 通過大鼠尿液NMR譜分析，檢測到的代謝物類型包括氨基酸如異亮氨酸(Ile)、纈氨酸(Val)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)等，糖類如葡萄糖(Glc)和麥芽糖(Mal)，鹽類如乙酰乙酸(AA)、丙酮(Act)、檸檬酸(Cit)、甲酸(For)等。

2.2 尿液NMR圖譜PCA分析結果 尿液樣本代謝數據PCA分析示，順鉑暴露1d后，R2X=67.4%，Q2=-0.195，三組標本的分布均有重疊，組間區分不明顯；其中，正常對照組標本分布較集中，主要分布在第2和第4象限；順鉑組和PNS組標本分布比較分散，兩組之間的差異較小。順鉑暴露第4天，R2X=67.4%，Q2=0.512，順鉑組、PNS組均與正常對照組有明顯區分，而順鉑組和PNS組之間有部分重疊。第8天，R2X=74.7%，Q2=0.474，正常對照組和其他兩組間有顯著差異，順鉑組和PNS組間雖有少數標本重疊，但兩組之間分布仍有顯著差異。

2.3 尿液NMR圖譜PLS-DA分析結果PLS-DA模型顯示，第1天，3組間均存在明顯差異。第4、8天，順鉑組、PNS組均與正常對照組有明顯差異；PNS組少數標本混合到順鉑組的集群，表明這兩個組的代謝有部分重疊。第4、8天時PLS-DA模型得分圖、驗證圖見圖1、2。

2.4 尿液NMR圖譜OPLS-DA分析結果 經OPLS-DA分析，第1天各組之間均有明顯差異。第4、8天順鉑組、PNS組均與正常對照組有顯著差異；第4、8天雖然PNS組有個別樣本混合到順鉑組的樣本集群中，但兩組間仍有明顯區分。PLS-DA和OPLS-DA模型質量評估參數見表1。

注：■示正常對照組,● 示順鉑組。PC1為第一主成分,PC2為第二主成分。

圖1 第4天時尿液PLS-DA得分圖

注：■示正常對照組,●示PNS組。PC1為第一主成分,PC2為第二主成分。

圖2 第8天時尿液PLS-DA得分圖

2.5 差異代謝物的篩選與鑒定 根據OPLS-DA分析結果，得出各組之間的差異代謝物。各組間的主要差異性代謝物相關系數見表2。順鉑暴露后第1、4、8天，各組大鼠之間的尿液代謝成分均存在差異。

表2 各組間存在的主要差異代謝物相關系數

注：“-”為相關系數絕對值小于0.553。C、M、D分別代表正常對照組、順鉑組、PNS組,其后的數字代表天數。

2.6 差異代謝物涉及的代謝通路分析 基于KEGG數據庫，各組之間的尿液差異代謝物涉及的代謝通路包括氨基酸的生物合成、檸檬酸循環(TCA循環)、糖酵解/糖異生途徑、戊糖磷酸途徑、甘油磷脂代謝、丙酮酸代謝、酮體合成和降解、苯丙氨酸代謝等，涉及能量代謝、糖代謝、氨基酸代謝和脂肪代謝等多個通路。

3 討論

順鉑屬于周期非特異性、高效廣譜抗腫瘤藥物，是臨床上應用最廣泛的化療藥物之一，當前臨床采用的多數聯合化療方案中均有順鉑。但順鉑的療效和腎毒性均與順鉑的劑量成正比，其腎損害嚴重時可致急性腎功能衰竭，而順鉑減量或停藥將影響患者化療的連續性，導致患者生活質量嚴重惡化。目前，尚缺乏有效的保護順鉑腎損害的藥物。因此在保留順鉑抗腫瘤作用的同時，如何降低其腎毒性是臨床上急需解決的難題。PNS含有三七皂苷Rl和人參皂苷Rg1、Rb1、Re等多種有效成分，故具有多種藥理作用，包括抗氧化、抗凋亡[11]、提高免疫功能、增強順鉑的抗腫瘤作用[4]。近年發現，PNS對腎臟疾病[5,6]包括順鉑腎損害有防治作用[7,8]。因此研究PNS對順鉑腎損害的保護有重要的意義。

順鉑誘導腎損傷的分子機制及PNS的防治作用機制均涉及多個通路、多個環節，如炎癥反應、氧化應激[1,8]、凋亡等[2,3]。代謝組學方法是研究生物體受到內、外界刺激時代謝產物變化的一種高通量分析技術。代謝組學技術檢測到的生化變化可以很容易地與傳統的檢測結果相聯系，從而更全面地評價藥物或毒物對靶器官的作用。NMR是利用原子核在磁場中的能量變化而獲得相關核信息的代謝組學技術，參照一定的規則或標準的氫譜比照，可直接鑒定出代謝物的化學成分，而信號的相對強弱則反映各成分的相對含量。NMR以高通量檢測和數據處理為手段，具有無損傷性、不破壞樣品的結構和性質、可在一定的溫度和緩沖范圍內進行生理條件或接近生理條件的實驗等優勢，可用于研究藥物治療作用及其機制[12]等。本研究發現，經PCA、PLS-DA和OPLS-DA等多變量模式識別分析可見，順鉑暴露后第1、4、8天，順鉑組、PNS組均與正常對照組有明顯的區分；與正常對照組比較，順鉑組和PNS組尿液的差異代謝物特點是低水平的2 -羥基丁酸酯、乙酰胺、苯甲酸、乙醇胺、馬尿酸、異丙醇、甲胺、甲基胍、丙二酸二甲酯、N-乙酰谷氨酸等，以及高水平的丙氨酸、乳酸、甘氨酸、氧化三甲胺等；雖然在順鉑組和PNS組之間有部分重疊，但仍可看到這兩個組之間存在差異，出現一系列差異代謝物，提示PNS組與順鉑組部分代謝通路相同。以上結果說明，采用NMR代謝組學方法研究尿液代謝物變化有助于區分順鉑組、PNS組和正常對照組。

丙酮酸是重要的能量物質和生理抗氧劑，在糖、脂肪和氨基酸三大營養物質的代謝中發揮關鍵作用。丙酮酸可升高肝臟的琥珀酸、乳酸等水平，以增強糖酵解，維持肝臟高水平的ATP，改善氧化還原狀態[13]；而且丙酮酸能快速提供ATP和GTP，從而改善酒精性肝病患者的肝功能[10]，以及能夠改善多種組織的缺血再灌注損傷[13]。另外，丙酮酸、琥珀酸和α-酮戊二酸通過三羧酸循環或糖酵解參與ATP 生成，維持細胞的基本功能。本研究發現，第8天時，與正常對照組比較，順鉑組和(或)PNS組的丙酮酸、琥珀酸和α-酮戊二酸水平升高，而β-葡萄糖、α-葡萄糖和麥芽糖水平下降；丙酮酸、琥珀酸和α-酮戊二酸在PNS組比順鉑組顯著下降，而PNS組β-葡萄糖、α-葡萄糖和麥芽糖比順鉑組顯著升高，即PNS可使順鉑誘導改變的代謝物向正常對照組的水平回調。以上研究結果提示，大鼠暴露于順鉑后，可出現能量代謝障礙，尤其是線粒體三羧酸循環能量生成不足，可能是順鉑腎損害的主要機制之一。

乙醇胺是哺乳動物和細菌的細胞膜中的主要成分，可來自于食物或體內絲氨酸的轉換。乙醇胺和甘油二酯一起合成磷脂酰乙醇胺(PE)，PE甲基化后可以轉換為磷脂酰膽堿(PC)。PE 和PC 是細胞膜、線粒體膜和內質網等細胞的各種膜結構的主要成分[14]；PE和肌醇濃度的光譜變化反映細胞膜的周轉。有報道在體內外肝細胞增殖需要有足夠的PE，而乙醇胺是合成PE所需的營養因子，乙醇胺可顯著提高肝細胞膜的PE水平，從而刺激肝細胞增殖[15]。由此可見，乙醇胺可影響細胞的增殖。本研究發現，在第1、4和第8天，與正常對照組比較，在順鉑組、PNS組乙醇胺低表達；而第8天乙醇胺在PNS組比在順鉑組表達升高，即PNS可升高順鉑誘導下降的乙醇胺，提示順鉑使乙醇胺表達下降，可影響細胞的膜代謝，尤其是線粒體膜合成的損傷，最終導致線粒體再生和能量合成受到損害。本研究發現，PNS 能升高乙醇胺表達，在第8天使之回調到正常對照組的水平，可能是順鉑腎損害和PNS防治作用的機制之一。

在代謝通路分析方面，本研究發現，各組出現的尿液差異代謝物所涉及的代謝通路主要包括TCA循環、碳水化合物的消化和吸收、糖酵解/糖異生途徑、磷酸戊糖途徑、酮體的生成和降解、淀粉和蔗糖代謝、丙酮酸代謝、氨基酸生物合成、蛋白質消化吸收等，這些差異代謝物及其所涉及的代謝通路主要集中在能量代謝過程，反映了代謝變化的廣泛性和復雜性，提示能量代謝模式發生改變以及線粒體功能受損傷可能是順鉑腎損害的主要機制。

綜上所述，采用NMR代謝組學方法可對順鉑腎損害大鼠經PNS干預后的尿液代謝特點進行分析，順鉑腎損害大鼠尿液中的代謝物發生明顯改變，尤其是與細胞能量代謝的改變有關；PNS干預對順鉑腎損害大鼠有一定的保護作用，可體現在改善尿液代謝物的變化，尤其是使丙酮酸、琥珀酸等向正常水平回調。

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Nuclear magnetic resonance metabonomics analysis of urine from rat with cisplatin-incuced nephrotoxicity before and after Panax notoginseng saponins intervention

HUANGZhenguang,YANGYufang,ZOUXiaoqin,HUANGChun,ZHOUJinling

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Objective To metabonomically analyze the urine samples from rats with cisplatin-induced nephrotoxicity before and after Panax notoginseng saponins (PNS) treatment by 1H nuclear magnetic resonance-based metabonomics (1H NMR), in order to provide basis for the study of PNS protecting cisplatin-induced renal injury.Methods Forty-five male SD rats were randomly divided into the normal control group, the cisplatin-only group and the cisplatin-PNS group (n=15, in each group). Rats in the cisplatin-only group and the cisplatin-PNS group were exposed to a single dose of cisplatin 5 mg/kg to induce renal damage. Rats in the cisplatin-PNS group were injected with 31.35 mg/kg PNS from day 1 to day 8. After exposure to cisplatin for 1, 4 and 8 days, the urine samples were analyzed using 1H NMR combined with multivariate pattern recognition. After centrifugation, 500 μL of the supernatant was placed in a nuclear magnetic tube, and urine was detected using a Varian 600 magnetic spectrometer to obtain an NMR spectrum. The normalized NMR data were analyzed by SIMCA-P+software for pattern recognition. The principal component analysis (PCA) was carried out with centralization conversion. Partial least-squares discriminant analysis (PLS-DA) was carried out by using the adaptive conversion. Orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) was applied to orthogonally correct PLS-DA model. We screened the statistically significant metabolites through the analysis of OPLS-DA and by analyzing the corresponding correlation coefficient of each metabolite. The metabolic pathways of different metabolites were obtained by mapping ID in the KEGG database of different metabolites.Results The urine 1H NMR spectra from the normal control group, the cisplatin-only group and the cisplatin-PNS group contained many metabolites, including acetoacetate, acetone, citrate, formate and glucose. Additionally, the Multivariate analysis in PCA, PLS-DA and OPLS-DA showed that there was a significant difference between the normal control group and cisplatin-only group, cisplatin-PNS group, and there was a part overlap between the cisplatin-PNS group and the cisplatin-only group on day 1, 4 and 8. Moreover on day 8, the expression of β-glucose, α-glucose, maltose and ethanolamine was lower, while the expression of pyruvate, succinate and α-ketoglutarate was higher in the cisplatin-only group. However, the expression of β-glucose, α-glucose, maltose and ethanolamine was higher, while the expression of pyruvate, succinate and α-ketoglutarate was lower in the cisplatin-PNS group as compared with that of the cisplatin-only group, and PNS could significantly callback the metabolites with abnormal expression.The alterations of metabolic pathways mainly included biosynthesis of amino acids, citrate cycle, glycolysis/gluconeogenesis, pentose phosphate pathway, glycerol phospholipid metabolism, pyruvate metabolism, synthesis and degradation of ketone bodies and phenylalanine metabolism. Conclusion The metabolites in urine change after exposure to cisplatin in rats. PNS could improve some metabolites, such as energy metabolism, glucose metabolism, amino acid metabolism and fat metabolism, these may be important mechanisms in PNS protecting against cisplatin-induced renal injury.

Panax notoginseng saponins; Cisplatin; renal injury; nuclear magnetic resonance; differences metabolites; urine; metabonomics

國家自然科學基金資助項目(81260598，81560729)。

黃振光(1969-)，男，本科，副主任藥師，主要研究方向為藥物不良反應監測。E-mail: 137109320@qq.com

簡介：楊玉芳(1968-)，女，研究生，主任藥師，主要研究方向為藥源性腎臟疾病的防治。E-mail: yyf_69@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.001

R445.2；R446.12

A

1002-266X(2016)46-0001-06

2016-06-21)