國標法和紙片法做食品中菌落總數的對比

仝偉建，祖新，段鵬，楊曉楠，李羽翡

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

國標法和紙片法做食品中菌落總數的對比

仝偉建，祖新，段鵬，楊曉楠，李羽翡

（甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030）

目的：利用紙片法和國標法同時測試食品中菌落總數，根據試驗結果來測試紙片法（非標法）在檢測食品微生物菌落總數檢驗中的準確性。方法：用紙片法和國標法（GB 4789.2-2010）在同一人員、相同的試驗條件下進行實驗，對所得的結果進行對比分析，測試紙片法在菌落總數檢驗中的準確性。結果：紙片法所得的結果和國標法結果對比顯示，對于污染嚴重的樣品，兩種方法具有顯著性的差異；對于相對潔凈的樣品，兩種方法的結果不具有顯著性差異。同時，紙片法所需的時間短，能有效地監控食品被微生物污染的嚴重程度，但是在精確度上和國標法還是有一定的差距。

國標法和紙片法；食品微生物；檢驗方法對比

隨著人們對食品安全性的重視，應用到食品微生物的檢測手段也越來越多，諸多新型的微生物檢測技術如雨后春筍般涌出,給微生物檢測工作帶來了飛躍式的發展,使得食品衛生檢驗工作得到了良好的改善。如ATP生物發光技術[1]和全自動微生物檢測法；在培養基中加入14C標記的碳水化合物或鹽類的底物，測量細菌代謝后產生是否產生14CO2的放射測量法；以DNA作為細菌的遺傳分子，在微生物檢測方面有著獨特的優勢，目前應用較多的有聚合酶鏈式反應（PCR）[2]和具有多樣化、自動化、微型化等特點的基因芯片技術[3]；利用微生物可以使電惰性底物（如碳水化合物、類脂、蛋白質等）代謝成電活性產物（如乳酸鹽、醋酸鹽、氨等）的電阻抗檢測法[4]；以氣相色譜法、mini-VIDAS法以及Vietk-AMS法為主的儀器分析檢測的方法[5]；流式細胞術等。這些技術對檢驗人員的素質、檢驗儀器、設備等要求較高，有些方法用在微生物檢驗中還不太成熟[6]，目前最常用的還是形態學和生理生化的方法，但是這些方法操作繁瑣、所需時間長、準備工作和后期廢棄物處理工作繁重，且需大量的專業技術人員。而紙片法由于使用方便、操作簡單，又能有效縮短檢驗周期而被廣泛地應用于監控食品被微生物污染的程度。但是紙片法所得的結果究竟準不準確？它和國標法所得的結果的差距又是多少？下面我們就來研究一下紙片法在食品菌落總數檢驗中的準確性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器

平板計數瓊脂（北京陸橋，批號：150504）,菌落總數測試片（國產某廠家），恒溫恒濕培養箱，超凈工作臺。

1.1.2 樣品

為確保試驗結果的覆蓋性和準確性，我們抽取容易受污染的食品（豆腐、肉）和相對較潔凈的食品（純凈水）各51個樣本。

1.2 方法

1.2.1 國標法

按照國標“菌落總數的測定”規定的方法進行試驗[7]。

（1）肉、豆腐樣品處理方法：稱取25 g樣品放入盛有225mL稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1～2min，制成1∶10的樣品勻液。

（2）純凈水樣品處理方法：瓶口用酒精棉球消毒后，以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 m L磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。

（3）用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1 m L，沿管壁緩慢注于盛有9 m L稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。

（4）按以上操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或加樣槍槍頭。

（5）根據對樣品污染狀況的估計，選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進行10倍遞增稀釋時，吸取1 mL樣品勻液于無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿。同時，分別吸取1 m L空白稀釋液加入兩個無菌平皿內作空白對照。

（6）及時將15～20 mL冷卻至46℃的平板計數瓊脂培養基（可放置于46℃±1℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉動平皿使其混合均勻。

（7）待瓊脂凝固后，將平板翻轉，36℃±1℃培養48 h±2 h。

（8）如果樣品中可能含有在瓊脂培養基表面彌漫生長的菌落時，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養基（約4 mL），凝固后翻轉平板，按（7）條件進行培養。

（9）按照GB 4789.2-2010中6.3要求的方法對平板進行計數。

（10）按照GB 4789.2-2010中7要求的方法進行結果計算。

1.2.2 紙片法

液體各取1m l，分別加入到2個測試片中；固體取25 g加入到225m l的0.85%的生理鹽水中，均質2min（下一步驟同液體樣品）。36℃培養18～24 h。計數和結果計算均按照說明書的要求進行。

2 結果

三種樣品不同檢驗方法結果見表1。

表1 三種樣品不同檢驗方法結果

3 分析與討論

對于污染嚴重的樣品，結果通過統計學計算得出兩種方法具有顯著性差異，國標法的結果要明顯高于紙片法；對相對潔凈的樣品，紙片法和國標法的結果有非常好的相關性，兩者之間無顯著性差異；紙片法培養時間對結果有明顯影響。培養時間過長,紙片容易干，細菌較多的樣品菌落可能重疊在一起，對結果分析的準確性有很大影響，個人認為14 h～16 h是比較理想的培養時間。

GB 4789.2-2008中有紙片法測菌落總數的方法，但是到2010年標準更新了以后08版的菌落總數的測定方法就被取消了，然而GB 4789.2-2003的標準仍然沒有作廢，這也從另外一個角度說明了紙片法具有一定的局限性。

紙片法和傳統的國標法比較，省略了試驗前期的準備工作和后期的廢棄物處理工作，大大節約了工作時間和勞動強度，并且在檢驗流程、培養時間等環節都更為簡便、快速[8]，用于測試相對潔凈的食品被細菌污染的程度還是值得使用的[9]。由于紙片檢測法，操作簡便，耗時較短，對于檢測潔凈度較高的食品無顯著差異，所以對于一些企業，在保證正常國標法進行出廠檢驗的同時，可以將紙片法作為一種監測手段。不僅可以對最終產品（成品）進行檢測，也可對生產過程中各個階段的半成品進行監測，通過產品的出廠檢驗與紙片法對生產產品的過程檢測相結合，對于保證生產各階段的質量控制，提高最終產品的質量，是大有裨益的。

［1］ 孫鳳霞.探析食品微生物檢驗技術的研究進展［J］.中國醫藥指南,2014，12（23）：69-70.

［2］ 路則寶，白現廣.分子生物學技術中微生物檢驗中的應用研究進展［J］.紅河學院學報，2013，11（2）：61-63.

［3］ 熊強，史純珍，劉釗.食品微生物快速檢測技術的研究進展［J］.食品與機械，2009，17（5）：788-789.

［4］ 劉濱思.微生物檢驗技術的研究進展［J］.食品科學，2013，01（09）：38.

［5］ 王雪麗，蔡麗萍.微生物檢驗技術研究的進展［J］.化工管理，2015（13）：177.

［6］ 林蕾，張煒.食品微生物檢驗技術的研究進展［J］.現代農業科學，2008，15（10）：97-99.

［7］ GB 4789.2-2010.食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定［S］.北京：中國標準出版社，2010.

［8］ 李桂賢，張曉威，金晶.紙片法與平板傾注法檢測菌落總數試驗報告［J］.中國衛生檢驗雜志，1991，1（2）：123.2.

［9］ 李洪，龔濤，達永淑，等.紙片探討影響大腸菌群快速紙片法的因素［J］.職業衛生與病傷，2002，17（3）：198-199.

TS207

：A

DOI 10.3969/j.issn.1672-6375.2016.12.010

2016-9-21

仝偉建（1983-），男，漢族，山東金鄉人，研究生，中級獸醫師，主要從事食品微生物檢驗工作。