CD4⁺T淋巴細胞穿孔素基因啟動子區低甲基化狀態在COPD中的作用

摘要：目的 探討慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者CD4+T 淋巴細胞穿孔素基因啟動子區甲基化狀態在該病中的作用。方法 分別分離8例COPD組和8例正常對照組外周靜脈血CD4+T淋巴細胞，提取RNA和DNA，檢測CD4+T 細胞穿孔素基因啟動子區域 DNA 平均甲基化水平以及穿孔素基因mRNA的表達。結果 COPD患者CD4+T淋巴細胞穿孔素基因啟動子區域DNA平均甲基化水平顯著低于正常對照組（P﹤0.05），但穿孔素基因mRNA的表達較正常對照組增強（P﹤0.05）。結論 COPD患者CD4+T淋巴細胞穿孔素基因啟動子區域DNA低甲基化狀態可引起穿孔素基因mRNA的過度表達，在COPD發病中具有重要的作用。

關鍵詞：低甲基化；穿孔素啟動子區；CD4+T 細胞；慢性阻塞性肺疾病

Abstract：Objective This study aimed at investigating the methylation status of perforin regulatory elements in CD4+ T cells from peripheral blood of COPD patients and its possible role in the pathogenesis of this disease. Methods The peripheral blood CD4+ T lymphocytes of eight patients with COPD and eight healthy controls were separated， and genomic DNA and RNA was extracted from the isolated cells. The methylation levels of perforin regulatory elements in peripheral blood CD4+ T lymphocytes were determined， expression of perforin investigated.Results The methylation levels in CD4+T lymphocyte perforin regulatory elements of patients with COPD were significantly lower than those in the control group， while the expression levels of perforin gene were relatively higher and the difference was statistically significant （P <0.05）.Conclusion Perforin regulatory elements of CD4+ T lymphocyte are hypomethylated in COPD patients， which activates perforin gene involoved in the development of this disease.

Key words：Hypomethylation； Perforin regulatory elements； CD4+ T cell； COPD

COPD是臨床上非常常見的一種疾病，嚴重影響廣大患者的身體健康。目前該病的發病機制不是十分明確，尤其是其肺功能不斷惡化的特點還需要進一步研究。相關文獻報導，自身免疫反應可能是該病不斷進展的原因[1]；但具體到這種反應是如何形成和發展的還不太清楚。我們前期動物實驗表明：CD4+T 淋巴細胞穿孔素基因啟動子區低甲基化可促進穿孔素基因的表達，從而參與自身免疫性肺氣腫的發生[2]；但該機制是否同樣適用于被稱之為自身免疫性疾病的COPD目前還不是十分清楚，有待進一步探討。本研究以COPD患者為研究對象，通過檢測CD4+T 淋巴細胞穿孔素基因啟動子區域 DNA 平均甲基化水平以及穿孔素基因mRNA的表達，旨在探討其在COPD發病中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料 2014年2月～4月在我院呼吸內科病房選取經常規治療達到穩定期的COPD患者8例，納入COPD組；同期招募正常健康人8例，納入正常對照組。COPD組患者均符合中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組制訂的慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013 年修訂版）中的診斷標準[3]；其中，男性 5 例，女性 3例，年齡45～68歲，平均（56.4±7.8）歲。正常對照組男性 4例，女性4例，年齡40～58歲，平均（49.8±6.2）歲。兩組年齡、性別差異無統計學意義，具有可比性。所有參加本次試驗研究的對象均排除風濕性關節炎、過敏性哮喘、系統性紅瘢狼瘡（SLE）等常見免疫系統疾病。所有受試者均簽署知情同意書，見表1。

1.2材料和方法

1.2.1主要材料 人外周血淋巴細胞分離液（天津灝洋生物制品科技有限公司），人CD4+T淋巴細胞分選磁珠（德國美天妮公司），亞硫酸氫鹽處理試劑盒、質粒抽提試劑盒（德國QIAGEN公司），PGEM-T和PGEM-T Easy載體系統（Promega公司），M-MLV逆轉錄酶（Promega公司），dNTP（Generay Biotech公司）等。

1.2.2方法 外周血CD4+T 淋巴細胞分離、DNA、RNA提取、穿孔素基因mRNA表達測定以及穿孔素啟動子區基因測序參照相關文獻進行[4，5]。

1.3統計學處理 采用SPSS11.5軟件包進行統計學處理，正態分布的計量資料以（x±s）表示，非正態計量資料以中位數（四分位間距）表示。采用t檢驗和秩和檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

兩組CD4+T淋巴細胞穿孔素基因啟動子區域DNA平均甲基化以及穿孔素基因mRNA比較：COPD患者CD4+T淋巴細胞穿孔素基因啟動子區域DNA平均甲基化水平顯著低于正常對照組（P﹤0.05）；但穿孔素基因mRNA的表達較正常對照組增強（P﹤0.05），見表2。

3討論

目前，專家們普遍認為，COPD患者盡管給予良好的治療，但其肺泡損害一直不斷發展；究其原因可能和其機體內存在的自身免疫反應有關。國外有學者研究發現：將自身免疫肺氣腫大鼠脾臟中的CD4+T 淋巴細胞注入正常大鼠體內可誘發其出現肺泡隔細胞凋亡及自身免疫性肺氣腫產生[6]，從而提示：CD4+ T淋巴細胞功能異常是肺氣腫形成的重要原因。因為COPD的主要病理變化包括慢性支氣管炎和肺氣腫，所以我們推測該機制亦適用于臨床上被稱為自身免疫疾病的COPD。

Motz GT 等[7] 進一步研究證實：從長期被動吸煙的小鼠體內分離T細胞并轉移到其他正常小鼠體內，后者會出現COPD樣的疾病；所以，該研究進一步支持我們上述假設成立的可能。

DNA甲基化是一種化學修飾，在許多高等生物的生命活動中起到重要作用。甲基化常發生在啟動子區CpG島，DNA甲基化升高常抑制基因表達，反之則促進其表達。

我們的研究表明：COPD患者CD4+ T淋巴細胞穿孔素基因啟動子區域DNA平均甲基化水平顯著低于正常對照組；但穿孔素基因mRNA的表達較正常對照組增強，結合我們前期動物實驗得到類似結果[2]，我們認為：CD4+ T 淋巴細胞穿孔素基因啟動子區低甲基化可促進穿孔素基因的表達，從而參與COPD的發生。究其具體機制，考慮可能和該區域低甲基化狀態誘發的肺泡隔細胞凋亡有關[2]。

目前，促甲基化藥物已在臨床上廣泛使用，無明顯副作用。故本研究可望為臨床上進一步探討COPD的發生機制及尋求新的治療方法提供思路。

參考文獻：

[1]Taraseviciene-Stewart L， Douglas IS， Nana-Sinkam PS， et al. Is alveolar destruction and emphysema in chronic obstructive pulmonary disease an immune disease[J].Proc Am Thorac Soc，2006，3（8）：687-690.

[2]Zhang C，Yan MY， Lu P，et al. Hypomethylation of perforin regulatory elements in CD4+T cells from rat spleens contributes to the development of autoimmune emphysema[J].Respirology，2014，19（3）：376-381.

[3]中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南（2013 年修訂版）[J].中國醫學前沿雜志（電子版），2014，6（2）：67-80.

[4]肖嶸，李勇堅，陸前進，等.SLE患者T淋巴細胞穿孔素基因啟動子區域甲基化狀態的探索[J].中華皮膚科雜志，2007，40（2）：89-91.

[5]李勇堅，肖嶸，李亞萍，等.SLE患者T淋巴細胞穿孑L素mRNA及其蛋白的表達[J].中華皮膚科雜志，2007，40（1）：57-58.

[6]Taraseviciene-Stewart L，Scerbavicius R，Choe KH，et al.An Animal Model of Autoimmune Emphysema[J].Am J Respir Crit Care Med，2005，171（7）：734-742.

[7]Motz GT，Eppert BL， Wesselkamper SC，et al.Chronic cigarette smoke exposure generates pathogenic T cells capable of driving COPD-like disease in Rag2 mice[J].Am J Respir Crit Care Med，2010，181：1223-1233.編輯/孫杰