超聲輔助提取漸尖毛蕨總黃酮的工藝研究

摘要：采用正交優化試驗，以總黃酮得率作為考察指標，對影響超聲輔助漸尖毛蕨總黃酮提取的因素進行了研究。結果表明漸尖毛蕨總黃酮的最佳提取工藝條件：乙醇濃度為60%，時間為40min，料液比為1∶30，溫度為60℃。在最佳提取條件下，其得率可達43.62mg/g。

關鍵詞：漸尖毛蕨；總黃酮；超聲輔助；提取工藝

Abstract：The factors of ultrasonic assisted extraxtion of total flavonoids from Cyclosorus acuminatus was studied by the orthogonal test in this paper.The results showed that the optimal extraction conditions were as flows：alcohol concentratrion 60%，extraction time 40 min，material liquid 1：30，temperature at 60℃.The yield can reach 43.62mg/g under the optimum extracting conditions.

Key words：Cyclosorus acuminatus；Total flavonoids；Ultrasonic assisted；Extraction technics

重慶縉云山的已經記載蕨類植物有38科74屬，149種，4變種。其中漸尖毛蕨Cyclosorus acuminatus（Houtt.）Nakai為金星蕨科毛蕨屬植物[1]，屬于縉云山廣布種，資源豐富，生于路邊濕地或溝邊、林緣。藥用。黃酮類化合物是植物的次級代謝產物，現代醫學研究表明，黃酮類化合物具有明顯的抗潰瘍、解痙、抗炎、抗菌、抗氧化、抗衰老、增強免疫力、軟化血管、降血糖及降血脂等生理活性作用；如何在植物中提取黃酮類化合物進行了廣泛的研究，但是目前中國對于漸尖毛蕨黃酮類化合物提取分離和應用的研究較少[2～10]。本文采用單因素和正交試驗方法研究超聲輔助對漸尖毛蕨中總黃酮提取效率的影響，為更合理開發利用蕨類藥用植物提供理論參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 漸尖毛蕨于2014年5月采重慶市沙坪壩區縉云山海拔400m處（經本校生藥學博士費曜鑒定），干燥，用粉碎機粉碎，過5目篩；鹽酸（重慶川東化工（集團）有限公司）；鎂粉（湖北省天門市化學試劑廠）；三氯化鐵；蘆丁標準品（UV≥98%，批號：130507，北京德威鈉生物技術有限公司）；Al（NO3）3·9H2O（上海振欣試劑廠，AR）；NaNO2（重慶北碚化學試劑廠，AR）；NaOH（重慶博藝化學試劑有限公司，AR）。

FW177型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DGG-9240B型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；SF-400A電子天平；RE-52旋轉蒸發儀器（上海亞榮生化儀器廠）；電磁爐（格蘭氏生活電器）；藥典篩（浙江上虞市五四儀器廠）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用電器有限責任公司）；UV-1200型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；SB-5200DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司，200W）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2方法

1.2.1標準曲線的制作 精密稱取在干燥至恒重的蘆丁對照品20mg，置50ml量瓶中，加70%乙醇適量，超聲使其溶解，放冷后加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。分別吸取0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分別置于15ml具塞試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.5ml，搖勻，放置6min；加10%硝酸鋁溶液0.5ml，搖勻，放置6min，加4%氫氧化鈉溶液5ml，搖勻，靜置15min，于510nm處測吸光度。以濃度（C）與吸光度（A）進行直線回歸，得方程：A=1.8064C-0.0188，r=0.9983。結果表明，在0.04～1.60mg/ml范圍內，吸光度與蘆丁溶液濃度呈現良好線性關系。

1.2.2漸尖毛蕨總黃酮含量及得率的測定 精密稱取漸尖毛蕨粉末1g（過藥典篩3號篩），置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇20ml，30℃超聲提取2次，30min/次，抽濾，合并2次濾液，水浴蒸干，殘渣加適量70%乙醇溶解轉移至50ml量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，即得漸尖毛蕨供試品溶液。精密吸取樣品溶液1mL，按“1.2.1”項下方法顯色后立即測定吸光度，由回歸方程計算出供試樣品中總黃酮的得率。總黃酮得率（%）=提取液中總黃酮質量/漸尖毛蕨質量×100%。

1.2.3超聲提取漸尖毛蕨總黃酮的研究 通過對超聲波法提取工藝中料液比、超聲時間超聲次數、乙醇濃度等影響漸尖毛蕨根中總黃酮提取率的因素進行單因素試驗，并在超聲溫度為60℃的情況下，在單因素的基礎上對其他因素進行正交試驗，確定最佳的工藝參數。

2 結果與分析

2.1定性實驗 ①鹽酸-鎂粉反應：取乙醇提取液2ml于試管中加鎂粉，再加入濃鹽酸數滴（1次加入），在泡沫處呈紫紅色。②三氯化鋁反應：取樣品溶液點在濾紙上，滴加1%三氯化鋁的乙醇溶液，吹干，在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈黃色熒光斑點。通過上述兩個定性實驗證明漸尖毛蕨根中含有黃酮類物質。

2.2單因素試驗結果與分析

2.2.1乙醇濃度對漸尖毛蕨總黃酮提取效果的影響 在超聲溫度40℃，超聲時間30min，料液比1∶20，提取2次條件下，選取乙醇溶劑濃度50%、60%、70%、80%、90%進行超聲提取。從實驗結果圖1-a可知，隨著乙醇濃度的增加，總黃酮得率增加，當乙醇濃度達到70%以上時，增大乙醇濃度，總黃酮得率增加緩慢，說明乙醇濃度過大時，雜質的溶出率大于總黃酮，再增加乙醇濃度意義不大，并且還會造成資源浪費，故超聲乙醇濃度選用50%～70%。

2.2.2超聲時間對漸尖毛蕨總黃酮提取效果的影響 在超聲溫度40℃，乙醇濃度60%，料液比1∶20提取2次條件下，選取超聲時間為20、30、40、50、60min進行超聲提取。實驗結果見圖1-b，隨著超聲時間的延長，總黃酮得率增加，當超聲時間延長到40min以上時，繼續延長超聲時間，總黃酮得率呈下降趨勢，說明時間延長，雜質溶出率大于總黃酮，故超聲時間選用30～50min。

2.2.3料液比對漸尖毛蕨總黃酮提取效果的影響 在超聲溫度40℃，超聲時間30min，乙醇濃度為60%，提取2次條件下，選取料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/ml）進行超聲提取，實驗結果見圖1-c。，隨著料液比的增加，總黃酮得率增加，當料液比達到1∶30（g/ml）以上時，增加料液比，總黃酮得率下降，故超聲料液比選用1∶20～1∶40。

2.2.4超聲溫度對漸尖毛蕨總黃酮提取效果的影響 在超聲時間30min，乙醇濃度60%，料液比1∶20（g/ml），提取2次條件下，選取超聲溫度30、40、50、60、70℃進行超聲提取實驗見圖1-d。隨著超聲提取溫度的升高，總黃酮得率增加，當超聲溫度升高到60℃以上時，總黃酮得率增加緩慢。若溫度繼續升高，漸尖毛蕨總黃酮可能受到破壞，得率也不會提高，故超聲提取溫度選用40～60℃。

2.3漸尖毛蕨總黃酮超聲提取的工藝優化 在單因素試驗的基礎上，選擇乙醇濃度，提取時間、料液比和超聲溫度4個因素進行正交試驗L9（43）見表1，以總黃酮得率為考察指標，確定提取漸尖毛蕨總黃酮的最佳工藝條件。

從表2極差分析結果得出，影響漸尖毛蕨總黃酮提取效率的影響因素：D>A>B>C，最佳工藝組合為A2B2C2D3，即乙醇濃度為60%，超聲處理時間40min，料液比1∶30（g/ml）和溫度60℃，因最佳提取工藝不在正交試驗設計之中，需要驗證試驗。

從方差分析結果表3可知，乙醇濃度（A）和超聲提取溫度（D）對超聲輔助提取漸尖毛蕨總黃酮有顯著性差異，超聲提取時間和料液比則無顯著性差異，如果產業化生產就主要考慮乙醇濃度和控制好提取溫度，在節約成本的前提下選擇適當的條件。

2.4驗證實驗 稱取漸尖毛蕨粉末3份，每份1g，按正交實驗所得的最佳提取工藝條件A2B2C2D3，進行驗證實驗，測定漸尖毛蕨中總黃酮的含量，測得黃酮得率43.62mg/g，RSD=1.471%（n=3），所得結果比正交試驗表中各組合效果要好，表明試驗所確定的最佳工藝為較優工藝。

3 結論與討論

本文研究了在超聲輔助下乙醇濃度、超聲時間、料液比、溫度等因素對漸尖毛蕨總黃酮提取的影響，結合正交試驗設計，確定了漸尖毛蕨總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度為60%，時間為40min，料液比為1∶30，溫度為60℃，影響漸尖毛蕨總黃酮提取效率的因素主次順序溫度>乙醇濃度>時間>料液比，其中超聲溫度和乙醇濃度對漸尖毛蕨總黃酮提取具有顯著性作用，在工業化生產時需要重點考慮。以最佳提取工藝提取漸尖毛蕨總黃酮的得率可達43.62mg/g。

西南地區蕨類資源十分豐富，如何開發利用蕨類資源中黃酮類資源是我們所要做的基本工作，本研究就是選用西南地區常見的一種蕨類為研究對象，采取超聲輔助的方法，以總黃酮得率為考察指標，力求為更好地開發蕨類植物中所含黃酮類化合物提供理論依據。

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編輯/安樺