干擾素—β對人前列腺癌PC—3細(xì)胞侵襲能力的影響

摘要：目的 探討干擾素-β（IFN-β）基因的表達(dá)變化對PC-3細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。方法 利用RNA干擾技術(shù)，下調(diào)前列腺癌細(xì)胞PC-3中IFN-β的表達(dá)量，采用劃痕愈合、Transwell侵襲實驗評價IFN-βsiRNA對PC-3細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響。結(jié)果 下調(diào)IFN-β表達(dá)顯著促進(jìn)了PC-3細(xì)胞的遷移（P<0.001）；侵襲實驗顯示，抑制IFN-β表達(dá)可明顯增強PC-3細(xì)胞的侵襲能力（P=0.001）。結(jié)論 IFN-β的表達(dá)抑制能夠增強PC-3細(xì)胞的遷移、侵襲能力。

關(guān)鍵詞：干擾素-β；遷移；侵襲；前列腺癌

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一[1，2]。隨著人們生活習(xí)慣、環(huán)境的逐漸變化，我國老年人數(shù)量的激增，前列腺癌在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。得益于早期的手術(shù)切除及輔助治療，局限性前列腺癌患者具有相對較長生存時間；一旦發(fā)展為晚期或轉(zhuǎn)移性疾病，其生存期將急劇減少。臨床上，外源性的I型干擾素已用于部分腫瘤的治療，包括毛細(xì)胞白血病、黑色素瘤、腎細(xì)胞癌以及卡波西肉瘤等[3]。本實驗擬采用劃痕愈合、Transwell侵襲實驗初步探討IFN-β對PC-3細(xì)胞侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實驗室惠贈）；RNA干擾序列（上海吉瑪公司化學(xué)合成）；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、RNA提取試劑盒TrizolReagen（美國Invitrogen公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠純化回收試劑盒（北京天根公司）；RPMI1640，Opti-MEM，胰酶（美國GIBCO公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌細(xì)胞PC-3在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2濕度下培養(yǎng)，每周傳代2～3次。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)LipofectamineTM2000說明書，取用適量的對數(shù)生長期PC-3細(xì)胞，通過LipofectamineTM 2000將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入PC-3細(xì)胞。取48μl Opti-MEM稀釋LipofectamineTM2000 2μl，室溫靜置5min；質(zhì)粒2μl，用Opti-MEM稀釋到終體積為50μl，室溫下靜置5min；混合上述兩液體，室溫下靜置20min，將其加入24孔板。轉(zhuǎn)染48h，更換上述培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)24h，換含有G418 500mg/L的完全培養(yǎng)液篩選目的細(xì)胞。

1.2.3劃痕愈合實驗 取PC-3細(xì)胞均勻鋪于6孔板中，每孔6×105細(xì)胞/2ml，過夜；用100μl槍頭垂直、直線劃開細(xì)胞，分別于0h、12h、24h、48h時，倒置顯微鏡下測量劃痕寬度。劃痕愈合率=（0h劃痕寬度-xh劃痕寬度）/0h劃痕寬度。

1.2.4 Transwell侵襲實驗 取適量PC-3細(xì)胞，用RPMI1640饑餓過夜，分為PC-3 IFN-β/147、PC-3 IFN-β/NC組，每組設(shè)3個孔。Matrigel膠4℃過夜融化，每個transwell上室中鋪入Matrigel膠50μl，37℃60min凝固。用0.25%胰酶消化上述細(xì)胞，1×PBS洗滌細(xì)胞，1000r/min離心5min沉淀細(xì)胞，用RPMI1640重懸細(xì)胞并將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106/ml，每個上室加200μl細(xì)胞懸液，下室加500μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。37℃5%CO2培養(yǎng)48h，取出上室，用棉簽擦除膜上室面內(nèi)的細(xì)胞，4%多聚甲醛溶液固定膜下室面中的細(xì)胞20 min，1×PBS清洗3次，5min/次，結(jié)晶紫溶液染色20min，1×PBS洗凈，干燥。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 IFN-βsiRNA的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 通過熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行觀察，所有細(xì)胞均顯示綠色熒光，提示成功轉(zhuǎn)染。

2.2 IFN-βsiRNA對細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 細(xì)胞劃痕愈合實驗中，PC-3 IFN-β/147組的劃痕愈合率高于對照組（P<0.001），見圖1。Transwell侵襲實驗中，PC-3 IFN-β/147、PC-3 IFN-β/NC組穿過Matrigel膠、聚碳酸酯膜的細(xì)胞數(shù)分別為（48.75±5.19）、（29±3.16）個，PC-3 IFN-β/147組較對照組明顯增多（P=0.001）。提示抑制IFN-β表達(dá)能夠促進(jìn)PC-3細(xì)胞的侵襲能力，增強其惡性表型。

3 討論

干擾素-β（IFN-β）是一類強大的免疫調(diào)控分子，已有的研究提示IFN-β可能部分通過對T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫調(diào)控，實現(xiàn)腫瘤的殺傷效應(yīng)，因而IFN-β對腫瘤細(xì)胞的直接作用容易被忽視。本研究采用siRNA干擾技術(shù)研究IFN-β對PC-3細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響，以期對IFN-β基因的功能有進(jìn)一步了解。首先，利用siRNA干擾技術(shù)，我們成功構(gòu)建了siRNA表達(dá)載體，IFN-βsiRNA；其次，劃痕愈合實驗表明下調(diào)IFN-β可顯著增強PC-3細(xì)胞的遷移能力（P<0.001），Transwell侵襲實驗表明抑制IFN-β表達(dá)可明顯增強PC-3細(xì)胞的侵襲能力（P=0.001）。結(jié)果揭示了IFN-β對人前列腺癌PC-3細(xì)胞的惡性表型具有調(diào)節(jié)作用，IFN-β表達(dá)抑制可能是前列腺癌進(jìn)展的原因之一。

前列腺癌中IFN-β基因的具體生物學(xué)功能及調(diào)節(jié)機制仍有待進(jìn)一步研究，從免疫學(xué)角度為切入點也為前列腺癌的研究提供一種新思路。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jemal，A.，et al.，Cancer statistics，2010[J].CA Cancer J Clin，2010.60（5）：277-300.

[2]Stat bite：worldwide cervical and uterine cancer incidence and mortality，2002[J].J Natl Cancer Inst，2006，98（15）：1031.

[3]Belardelli，F(xiàn).，et al.，Interferon-alpha in tumor immunity and immunotherapy[J].Cytokine Growth Factor Rev，2002，13（2）：119-34.

[4]Lee，J.，et al.，Adenovirus-mediated interferon-beta gene transfer inhibits angiogenesis in and progression of orthotopic tumors of human prostate cancer cells in nude mice[J].Int J Oncol，2006，29（6）：1405-1412.

編輯/趙恒德