探討MSCs作為攜帶PEDF基因載體的可行性研究

摘要：目的 本研究采用重組色素上皮源性因子腺病毒（Ad-PEDF）轉染小鼠骨髓間充質干細胞（MSCs）后，評估MSCs作為攜帶PEDF基因載體的可行性。方法 Ad-PEDF在HEK293細胞中擴增，并純化后。將其轉染入MSCs（MSCs-PEDF），用Western Blot和ELISA檢測培養上清液中PEDF的表達。結果 用Western Blot檢測細胞培養上清中的PEDF為陽性表達。ELISA檢測培養上清中PEDF濃度為78.8±4.8 ng/ml。結論 MSCs可以作為使用PEDF基因治療腫瘤的載體。

關鍵詞：骨髓間充質干細胞；色素上皮衍生因子；基因治療；抗血管生成

血管生成是腫瘤生長和轉移的必要條件[1]，因此，抗血管生成治療是腫瘤治療的一個重要部分。色素上皮衍生因子（PEDF）是已知最強的內源性血管生成抑制因子，可通過抑制血管內皮細胞增殖、遷移及誘導其凋亡來發揮其抗血管生成作用[2]。重組PEDF蛋白以及病毒載體介導的PEDF基因治療已應用于多個實驗研究，并顯示出治療前景[4]。骨髓間充質干細胞（MSCs）作為一種新穎、有效的靶向腫瘤細胞的載體可能為提高PEDF的治療效果提供一種新的策略[3]。本研究擬通過重組色素上皮源性因子腺病毒（Ad-PEDF）轉染小鼠MSCs后，從而評估MSCs作為腫瘤基因治療的載體的可行性。

1 資料與方法

1.1細胞培養

1.1.1 293細胞的培養 將293細胞置于含有10%FBS及100U/ml阿米卡星的DMEM培養基中，在37℃、5%CO2， 95%濕度條件下的孵箱中培養，以 0.25% 的胰蛋白酶消化，一般2～3d傳代一次。

1.1.2人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的分離及培養 取產后新鮮臍帶15～20cm，用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端注入0.1%的膠原酶消化。將收集的消化液體離心（1500轉/min）3min。接種于培養瓶中，置于孵箱中培養。

1.1.3小鼠MSCs的分離、培養及鑒定取。6～8周齡C57BL/6雌性小鼠，處死后在無菌條件下取股骨和脛骨，離心后用含有10% FBS的DMEM培養基重懸細胞，并接種于方瓶中，置于孵箱中培養。

1.2 PEDF重組腺病毒載體（Ad-PEDF）的擴增與純化

1.2.1 Ad-PEDF的擴增 將293細胞傳代培養，當其密度達到90%時，加入適量病毒上清感染細胞。約2～3d后出現細胞病變，待細胞幾乎變圓，且有一半細胞漂浮時，收集細胞上清液至離心管中，3000轉/min，4℃，離心10min，將上清液用0.45μm濾器過濾，保存于-80℃。

1.2.2病毒純化 使用Vira TrapTM Adenovirus Purification Maxiprep Kit 純化病毒（具體步驟見說明書）。

1.2.3病毒滴度測定（TCID50法） 將293細胞以1×104個/孔接種于96孔板中，將病毒液按對數級稀釋（10-5～10-10），每個濃度設置10個復孔，連續觀察10d后記錄每個稀釋度出現CPE（致細胞病變效應）的孔數，計算細胞病變率。如果某一濃度各孔細胞全部病變，比率為1，如無細胞病變，則比率為0。

1.3重組腺病毒體外感染MSCs 加入含有適量 Ad-PEDF 重組腺病毒低糖DMEM，感染復數（MOI）=1500，搖勻，置于孵育箱中培養4h后換液，48h后收集感染后MSCs。

1.4檢測 MSCs-PEDF 中 PEDF蛋白的體外表達

1.4.1樣品制備 加入Ad-PEDF的MSCs作為對照。收集各組的培養液上清，采用Western blot 體外表達的PEDF蛋白進行鑒定分析，采用ELISA測定培養上清中PEDF濃度，分別測定三組培養上清中的PEDF濃度。

1.5統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件進行統計學分析，實驗所得數據采用（x±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析（ANOVA）；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1小鼠骨髓間充質干細胞（MSCs）的分離培養和鑒定 MSCs的原代培養：原代細胞生長較慢，2w左右可長滿瓶底，傳代后細胞生長速度則明顯加快，可得到較高純度的MSCs。傳代3次后，細胞形態較為一致，呈長梭形，多為平行排列生長或漩渦狀生長。

2.2重組腺病毒驗證及滴度測定 DNA電泳顯示Ad-PEDF泳道在1200～1500bp之間出現一單一條帶。說明擴增的腺病毒含有PEDF基因。

2.3 Ad-PEDF轉染MSCs后重組PEDF的體外表達檢測 轉染了Ad-PEDF的MSCs（MSCs-PEDF）細胞裂解液及培養液上清在50KD處均出現一明顯條帶，說明MSCs-PEDF可表達重組PEDF并分泌至細胞外。ELISA檢測結果表明，MSCs-PEDF培養上清中的PEDF濃度可78.8ng/ml，而MSCs-LacZ及MSCs則僅微量表達。

3 討論

在本研究中，我們通過體外實驗證明了攜帶有PEDF基因的MSCs在細胞裂解液及培養液中陽性表達PEDF。腫瘤進展依賴于新的血管網的生成以供給其營養[7]。血管生成在腫瘤的發生、發展及轉移過程中都發揮著重要作用。如果能有效地阻止腫瘤的血管生成，就有望控制手術或放、化療治療后腫瘤的復發和轉移。

PEDF最初是從胎兒視網膜色素上皮細胞中分離得到，而近年來，人們發現它有著強有力的抗血管生成活性[4]。PEDF可通過以下機制來實現其對血管生成的抑制作用：①抑制內皮細胞增殖和遷移以及形成小管；②通過Fas/FasL通路誘導內皮細胞凋亡；③下調促血管生成因子特別是VEGF的表達，從而打破促血管生成因子和抗血管生成因子之間的平衡[5]。以上的生理特性，奠定了PEDF應用于腫瘤治療的基礎。目前，已有大量的實驗研究顯示，PEDF可顯著抑制腫瘤的生長和轉移。純化的重組蛋白在體內易于降解，純化困難，價格較昂貴。而以病毒或非病毒為載體的基因治療難以在腫瘤組織內達到較高的治療濃度。這些缺點大大降低了它們潛在的治療效果和應用價值。因此，如何將PEDF基因有效地運送到腫瘤部位，并使其在局部持續表達是本實驗今后的研究重點。

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編輯/蔡睿琳