自噬研究的新動向—自噬流

摘要：自噬是目前生物醫學領域研究熱點之一，廣泛參與各種生理和病理過程。既往對自噬的研究多以自噬體的多少評價自噬水平的強弱，新近發現自噬體的增加并不能從本質上反映自噬的水平，僅僅能夠反映自噬的誘導，或者自噬體清除的抑制。因為從自噬流的角度來看，自噬體的數量受形成和清除兩方面影響，準確全面地評估自噬不僅包括自噬體的檢測，還包括動態觀察整個自噬流的過程是否通暢。我們提倡結合使用多種自噬檢測方法以獲取可靠數據，將動態和靜態檢測方法結合，更能有效說明細胞自噬的發生以及自噬流的變化。

關鍵詞：自噬；自噬流；透射電子顯微鏡

New Trends in Autophagy Research-Autophagy Flow

MA Pei-ze1，SUN Zheng-xin2，JIANG Yue-hua3

（1.Weihai Hospital of Traditional Chinese Medicine，Weihai 264200，Shandong，China；2.Maternal and child health care hospital of Huancui District，Weihai 264200，Shandong，China；3.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250001，Shandong，China）

Abstract：Autophagy is one of the hot topics in biomedical research.Which is widely involved in various physiological and pathological processes.Previous studies on autophagy have evaluated the level of autophagosome，and recently found that the increase of autophagosome can not reflect the level of autophagy in nature.It can only reflect the induction of autophagy and the inhibition of autophagosome.From the point of autophagy flux，the number of the autophagosome is affected by the formation and removal of the two aspects，accurate and comprehensive assessment of autophagy not only includes the detection of the body，but also includes the dynamic observation of the entire flux ofautophagy is smooth.We promote the combination of dynamic and static detection methods to obtain reliable data，which can effectively explain the occurrence of autophagy and the changes of autophagy flux.

Key words：Autophagy；autophagy flux；Transmission electron microscope

目前，細胞自噬已經成為繼凋亡之后生物醫學最熱門的研究領域之一，越來越多的研究表明自噬可能與心血管疾病、腫瘤以及神經退行性變等多種病理生理過程密切相關[1]。隨著研究的深入對自噬的檢測也提出了更高的要求，許多學者，尤其是剛剛進入這一領域的研究者們迫切想要掌握研究自噬的關鍵是什么，遺憾的是在自噬的研究過程當中，并沒有一個絕對的研究準則適于所有的實驗內容供學者遵循，因為有些常用自噬檢測方法在某些細胞、組織或器官中并不合適，甚至是存在問題的[2-5]。這就需要我們重新認識自噬，找到客觀的方法評價自噬。

自噬是一個高度動態、多步驟的生物過程，在許多環節可以被調控，大致可以分為四個部分：自噬膜（sequestering phagophore）、自噬體（autophagosome）、自噬內涵體（amphisome）以及自噬溶酶體（autolysosome），其中自噬體與內涵體結合形成自噬內涵體，自噬內涵體或自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體[6-8]。現有的大部分文獻都是通過檢測自噬體的數量來評價自噬水平，基于上述流程我們可以發現通過電鏡等手段檢測到的自噬體的積累，既可以反映自噬的誘導，也可以反映自噬體的消耗減少，例如，內涵體或溶酶體低效率的融合，影響到整個底物運輸過程，會抑制自噬體向自噬內涵體或自噬溶酶體的成熟轉化，當然自噬底物降解速率的減慢也會導致整個自噬流程的減弱，從而出現自噬體的蓄積。如何正確評價自噬情況就需要我們區分通常情況下自噬體短暫的蓄積是因為誘導導致的，還是自噬完成的效率低下導致的。既要靜態檢測自噬體水平，也需要我們動態監測自噬底物來證實底物到達了溶酶體，并且在合適的時間被降解，以及自噬對細胞成分降解率的變化。這就提出了一個新的概念—自噬流，自噬流的含義包含了整個自噬過程，包括了自噬結構的形成，底物向溶酶體的運送（通過溶酶體與自噬體或者自噬內涵體的融合），以及底物的降解和大分子物質釋放回細胞質的整個流程。本文就有關自噬流的檢測做一簡單介紹，并對各種檢測方法作出評價。

1 透射電子顯微鏡進行形態學觀察

透射電子顯微鏡是從形態學上觀察自噬現象最直接，最經典的方法，可以用于監測選擇性和非選擇性自噬，能夠定性定量檢測自噬過程中各種結構，包括吞噬泡、自噬體、自噬內涵體，自噬溶酶體等，細胞質的降解區域被吞噬泡隔離開，吞噬泡進而轉化成自噬體，自噬體是自噬的形態學特征，具有雙層膜結構，包含著形態完整的細胞器。雖然電鏡是檢測自噬應用最廣泛的方法，但同時也是最容易出問題的，主要是方法的問題：①選擇被檢測的標本是電鏡檢測自噬成功的關鍵。固定體外組織相對直接一些，但是要注意固定標本時去掉沒有意義沒有價值的部分；②雙層膜并不是自噬體的超微結構標志，線粒體也是含雙層界膜的細胞器，破壞的線粒體形態學與自噬體相似，但線粒體內膜有折瘠，而自噬體內膜不會折瘠；③有些情況下需要對電鏡圖像進行斷層重建，進一步確定自噬結構是球形的，以免和其他在薄層外觀上相類似的結構混淆，比如含有沉淀物的線粒體；④分析一個細胞單個層面的時候容易被誤導或者難以分析自噬結構，如果有足夠的結構分辨率便能夠解決上述問題，而聚焦離子束/掃描雙束電子顯微鏡能夠更加簡易的進行三維分析。另外被證明能夠有效分析自噬中復雜膜結構的技術方法還包括三維電子斷層掃描、冷凍電子顯微鏡、關聯光電顯微鏡等（CLEM）對于確認自噬體很有幫助。

電鏡雖然是檢測自噬的金標準，但是應用電鏡時必須非常嚴格操作避免偏倚，同時我們推薦靜態的電鏡圖像配合串聯mRFP-GFP-LC3有助于分析自噬流以及降解物的結構。采用動態觀察的方法，多個時間點采集數據更能反映自噬流的真實情況。

2 熒光顯微鏡下采用融合蛋白示蹤自噬

由于電鏡耗時長，不利于監測自噬流，新近利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的現象開發出了GFP-LC3指示技術：無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當于一個自噬體，可以通過計數評價自噬活性的高低，但無法反映自噬體呈遞至溶酶體的過程來從形態學上觀察自噬流。而mRFP-GFP-LC3串聯熒光蛋白腺病毒通過瞬時高效感染細胞，配合活細胞工作站能夠做到實時監測自噬流，GFP和mRFP用于標記及追蹤LC3，GFP的減弱可指示溶酶體與自噬體的融合形成自噬溶酶體。由于腺病毒載體感染效率高，很多細胞都能達到近99%，純化后的腺病毒可以直接進行動物活體注射。另外LC3持續表達可能會影響細胞正常功能，因此腺病毒這種不整合基因組的載體更適合作為一種工具型病毒載體。這種串聯的熒光蛋白表達載體系統直觀清晰的指示了細胞自噬流水平，是自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。

3 Western-blotting檢測自噬底物的降解

通過標記細胞內部長壽蛋白的降解，或者通過Western-blotting確定降解底物含量的減少，均可用于佐證自噬的完成。起初自噬所降解的底物被認為是隨機的，但是后來的研究表明有些蛋白是選擇性降解的，在這些蛋白之中研究最為透徹的是蛋白P62，最近已經認為可以通過自噬特異性被降解，主要通過Western blotting方法檢測P62蛋白水平的表達，一般情況下，P62蛋白水平的高低與自噬的活性成反比，P62的增加提示自噬/溶酶體降解途徑被抑制，因此其表達量的變化也可用于監測自噬流。但是單純依靠自噬底物蛋白的降解很難斷定自噬的發生，因為自噬底物的蛋白往往參與細胞內部其他的信號通路的調節，此種蛋白可能通過其他的信號通路降解。更為準確的方法是，通過電鏡或檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ，判斷自噬的發生，并配合自噬調節劑如3-甲基腺嘌呤，如果能夠抑制自噬底物降解，則說明整個自噬流的發生。

4 自噬流的人為干預

通過人為干預來促進或者抑制自噬功能后觀察細胞行為或效應分子的變化能夠使研究結論更具有說服力。目前認為促進或者抑制自噬的方法有藥物處理、自噬基因敲除或過表達等。

在自噬過程中，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt/mTOR信號通路發揮主要作用，而PI3K是該通路的關鍵分子。根據底物特異性，PI3K又可以分為3類，Ⅰ類PI3K作為信號轉導，在哺乳動物體內自噬發生的不同階段起抑制自噬的作用，Ⅲ類PI3K在自噬發生過程中起主要作用，通過磷酸化磷脂酰肌醇形成3-磷酸磷脂酰肌醇，從而促進自噬的發生，而Ⅱ類PI3K與自噬的關系至今知之甚少。根據調控通路，可以將自噬調控劑分為：①PI3K抑制劑包括3-甲基腺嘌呤（3-MA）、渥曼青霉素和LY294002。其中應用最多的3-MA主要是通過抑制Ⅲ類PI3K活性，阻斷3-磷酸磷脂酰肌醇的產生，影響自噬體的起始和成熟，從而抑制自噬的發生；②雷帕霉素靶蛋白抑制劑，mTOR作為自噬啟動階段的關鍵調節因子，活化后可抑制自噬的發生，其抑制劑包括雷帕霉素，雷帕霉素衍生物，AZD805，Torin1，PP242，WAY600等；③肌醇單磷酸酶抑制劑，包括氯化鋰、卡馬西平等；④氯喹與羥氯喹作為一類常用的自噬抑制劑，其抑制自噬的機制主要是通過改變溶酶體的pH值，影響溶酶體對底物的降解，同時阻斷自噬體與溶酶體的融合從而影響自噬流。另外通過RNAi干擾自噬相關基因的表達后，細胞表現為自噬功能缺失。我們提倡人為干預自噬與多種自噬檢測方法結合使用以獲取可靠數據，將動態和靜態檢測方法結合，更能有效說明細胞自噬的發生以及自噬流的變化。

5 討論

自20世紀50年代，細胞自噬研究的先行者ChristiandeDuve運用電子顯微鏡技術觀察到自噬泡的存在，到Science認為細胞自噬為科技領域六大研究方向之一，自噬已經成為生物醫學最熱門的研究領域之一，特別是過去的10年見證了自噬研究的飛速發展。越來越多的研究表明自噬可能在多種疾病過程發揮重要作用，但既往的諸多研究卻發現自噬在某些生物學過程中的利弊一直沒有定論，我們分析其關鍵原因之一是自噬的評價方法不當。既往研究多以自噬體的多少評價自噬水平的強弱，然而Atg8/LC3水平的增加，或者甚至是自噬體的出現，這些并不能從本質上反映自噬的強弱，僅僅能夠反映自噬的誘導，或者是自噬體、自噬內涵體清除的抑制。因為從自噬流的角度來看，自噬體的數量受形成和清除兩方面影響。既往多認為自噬體增多是自噬過度導致生成過多所造成，而新近研究表明自噬體的蓄積多是自噬清除功能障礙所致，如何干預自噬體的清除及底物的降解可能成為今后的研究熱點和新藥開發方向。

另外，從自噬特點中可以看出，自噬一旦啟動，必須在度過危機后適時停止，否則，其非特異性捕獲胞漿成分的特性將導致細胞發生不可逆的損傷。這也提醒我們在研究自噬時一定要動態觀察，任何橫斷面的研究結果都不足以評價自噬的活性。目前，已經報道了很多因素能誘導細胞發生自噬，如饑餓、生長因子缺乏、微生物感染、細胞器損傷、蛋白質折疊錯誤或聚集、DNA損傷、放療、化療等等，這些刺激信號如何傳遞、哪些自噬蛋白接受信號、又有哪些自噬蛋白去執行等很多問題還有待進一步解答。

參考文獻：

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編輯/蔡睿琳