阿托伐他汀鈣抑制Ang Ⅱ上調HUVCs誘導型一氧化氮合酶的表達并增加NO的生成

摘要：目的 觀察阿托伐他汀鈣對AngⅡ誘導的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）表達誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）及一氧化氮（nitric oxide，NO）生成的影響，討論二者之間的關系和可能機制。方法 體外培養HUVECs，用102030 阿托伐他汀鈣預處理HUVECs 24 h， 再與10-7 mol/L AngⅡ共同孵育12 h；通過 RT-PCR 和 Western Blot 分別檢測iNOS mRNA 和蛋白表達水平；通過Griees 反應測定上清NO 釋放量。結果 與無刺激組比較，10-7 mol/L AngⅡ刺激HUVECs 12 h后明顯上調iNOS mRNA 及蛋白表達，P<0.001； 基礎狀態下HUVECs 不表達iNOS（無論mRNA 還是蛋白），10-7 mol/L AngⅡ刺激8 h后明顯增加iNOS mRNA 和蛋白表達（與對照組相比，P<0.001）；不同濃度（10、20、30 μmol/L）阿托伐他汀鈣預處理24 h 明顯抑制AngⅡ對HUVECs iNOS mRNA及其蛋白表達的上調作用（與 AngⅡ組相比，P<0.001，有統計學意義；但阿托伐他汀鈣不同濃度組間比較P>0.05，無統計學意義）。與無刺激組比較10-7 mol/L AngⅡ明顯減少NO 的釋放，P<0.001，有統計學意義；與 AngⅡ組比較，阿托伐他汀鈣干預24 h 后呈濃度趨勢增加NO 的釋放，P<0.001，有統計學意義。結論 阿托伐他汀鈣呈濃度效應抑制AngⅡ誘導的HUVECs 表達iNOS， 并呈濃度趨勢增加內皮NO的釋放。

關鍵詞：阿托伐他汀鈣；AngⅡ；人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）；一氧化氮合酶（iNOS）；一氧化氮（NO）

Atorvastatin Calcium Inhibits Ang II to up Regulate the Expression of HUVCs Inducible Nitric Oxide Synthase and Increase the Production of NO

DING Yue-xia，ZHANG Ming-hua，WANG Chong-chong，DAI Shu-jing，LIN Li-rong

（Internal Medicine-Cardiovascular Department，The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510700，Guangdong，China）

Abstract：Objective 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme a （HMG-CoA） reductase inhibitors（atorvastatin） reduce lesion formation in animal models of atherosclerosis by mechanisms that have not been defined completely. We hypothesized that atorvastatin inhabit the expression of inducible nitric oxide release（iNOS） stimulated by AngⅡ to protect the vascular wall which may be related to the enhancement on expression of endothelial nitric oxide synthase（eNOS）.Methods Human umbilical vein was isolated and culcured passage 3～5 of cultured HUVECs were preincubated for 24 h with Cig（0.1 mol/L，1 mol/L，10 mol/L，100 mol/L），then incubated with10-7mol/L AngⅡfor 12 h. Total RNA was extracted， and eNOS expression both mRNA and protein was assessed by RT- PCR and Western Blot. NO production was measured via griess reaction. Results Atorvastatin markedly enhanced the expression of AngⅡ- induced iNOS （P<0.01， P<0.001） ， both mRNA and protein level， and stimulated NO release from human umbilical vein endothelial cells activated by AngiotensinⅡ （0.1M ， atorvastatin 10M ， 20M ， 30M P<0.001） . Conclusion Taken together， these findings demonstrate that atorvastatin could decreased the expression of iNOS induced by AngⅡ， and stimulated NO release from HUVECs， which maybe correlate to a transcriptional mechanism of eNOS expression.

Key words：Atorvastatin calcium； Ang II； Human umbilical vein endothelial cells （HUVECs）； Nitric oxide synthase （iNOS）；Nitric oxide （NO）

阿托伐他鈣（Atorvastatin，Ato）屬于屬3-羥基3-甲基戊二酰赴美A（HMG-CoA）還原酶抑制劑，是一種新型強化降脂藥，已經廣泛用于動脈粥樣硬化、冠心病以及高脂血癥等臨床治療。但有關靜脈內皮受損、動靜脈造瘺、靜脈血栓形成等病理生理改變中，他汀類藥物是否具有同樣的保護作用，目前研究甚少。我們在前期研究的基礎上，使用不同濃度的阿托伐他汀鈣預處理體外培養的人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），以觀察該藥對AngⅡ誘導的HUVCs iNOS表達及NO生成的影響，從而為靜脈血栓性疾病提供新的藥物保護作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 健康產婦正常分娩新生兒臍帶，標本取自廣州醫科大學附屬第五醫院婦產科。內皮細胞培養基、胰蛋白酶等細胞培養以及AngⅡ、Western Blot所需的化學試劑均購自美國 Sigma 公司；特級胎牛血清為美國 Hyclon 公司產品；Trizol 試劑、RT- PCR 兩步法試劑盒購自 Invitrogen 公司；鼠抗人 iNOS 單克隆抗體購自美國 Bio Lab 公司；NO 測定試劑盒購自南京建成生物工程公司；Western Blot 試劑盒（ 含堿性磷酸酶標記的二抗）自 Promega 公司；PVDF 膜、預染SDS-PAGE 低分子量 Marker 及發光 Marker、感光片購自美國Biorad 公司。BCA 蛋白定量試劑盒購自美國 Pierce公司；脫脂奶粉購自紐西蘭安怡；阿托伐他汀鈣由輝瑞公司惠贈。

1.2方法

1.2.1原代人臍靜脈內皮細胞培養、傳代、鑒定及分組[1] 細胞分組：①無刺激組，除培養液（含10%FBS）外不加任何處理；②AngⅡ組：AngⅡ（0.1 μM）與 HUVECs共孵育12 h。③阿托伐他汀鈣+AngⅡ組：先用阿托伐他汀鈣（10 μM、20 μM、30 μM）處理細胞 24 h，再與0.1 μM AngⅡ一起孵育 12 h。各組細胞以（2～3）×105個/ml接種至6孔板（每組6孔），待細胞長至 90%以上的融合狀態時棄舊培養液，換為含10% FBS 的RPMI 164（0.2 ml/孔），次日按上述方法分別處理細胞，到時間后收集并提取總RNA：采用Trizol試劑一步法抽提。

1.2.2 RT- PCR[1-3] 嚴格按試劑盒說明書，不再累贅。RT-PCR結果紫外線透射儀觀察，用凝膠成像分析系統處理，進行灰度掃描，以條代吸光度值 A 表示對應目的片段的表達量，以內參 GADPH片段的量校正，將二者的吸光度值A進行分析。

1.2.3 Western Blot 詳見參考文獻[1-3]，具體不詳述。以每條泳道上10 μg蛋白，以空白組電泳條代灰度值設為1，其余與之進行灰度比值。每次實驗至少獨立進行4次。

1.2.4 NO的測定 嚴格按照試劑盒說明書進行操作[2]：用 721 型可見光分光光度儀測定 550 nm的A值。根據所得的A 值，計算NO的濃度，繪制標準曲線。

1.3統計學方法 采用SPSS 11.0統計軟件。結果均以（x±s）表示，數據處理采用單因素方差分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1阿托伐他汀鈣下調iNOS mRNA的表達 HUVECs未刺激狀態下無 iNOS mRNA 表達，0.1 μmol/L AngⅡ刺激12 h后明顯上調iNOS mRNA表達，10 μM、20 μM、30 μM阿托伐他汀鈣均明顯抑制iNOS mRNA（下調18.5%、17.9%、56.2 %，P<0.01），見表1和圖1。

2.2阿托伐他汀鈣抑制iNOS蛋白表達 HUVECs基礎狀態iNOS表達極低（9.93±2.09），0.1 μM AngⅡ與HUVECs共同孵育12 h后明顯上調iNOS蛋白表達（62.9±5.41，與無刺激組相比P<0.001）；10 μM、20 μM、30 μM Ato也明顯抑制iNOS蛋白表達，分別下調5（P<0.01）、25.5、51.8（%， 與AngⅡ組相比P<0.001） ，這與對iNOS mRNA的影響類似，見表1。

2.3阿托伐他汀鈣增加HUVECs NO釋放HUVECs基礎狀態下，NO釋放量為（50.21±4.39） μM，0.1 μM AngⅡ刺激12 h使NO釋放量減少57.5%[（21.33±4.81） μM，P<0.001]。經過不同濃度Ato預處理24 h后，NO釋放增加（P<0.001），見表2。

3 討論

我們以往的研究證實AngⅡ損傷血管內皮，抑制內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS），卻上調iNOS，總體上明顯減少內皮型NO的生成[1-3]。而血管內皮細胞產生的內皮源性NO對維持正常的血管生理功能非常關鍵，它參與調節血管張力、血小板黏附和聚集、黏附分子表達以及血管平滑肌細胞的增殖遷移等多種病理生理過程[8]。本研究觀察到阿托伐他汀鈣可抑制AngⅡ誘導的 HUVECs iNOS 的表達，卻增加內皮NO的釋放，是否與其參與調控eNOS的表達有關，不得而知。學者的關注熱點在于eNOS和血管內皮細胞釋放NO的關系上，較少關注iNOS在阿托伐他汀的心血管保護作用的意義，而iNOS也是炎癥反映指標之一，血管內皮細胞正常時無表達，一旦發生炎癥或應激狀態、內皮損傷即被激活，從而發揮其促炎、激活血小板、增強白細胞的黏附作用，從而促進動脈粥樣硬化的發生。如前所述，阿托伐他汀屬于強效降脂藥物，廣泛用于臨床，尤其對動脈粥樣硬化和動脈血栓性疾病有積極的預防和治療作用。但有關該類藥物在靜脈血栓、靜脈動脈化（如動靜脈造瘺或冠脈搭橋術后血管硬化、血栓形成、再狹窄和閉塞）中的應用依據還缺乏相關證據，尤其是基礎研究較為滯后。

總之，我們的研究證明阿托伐他汀可以抑制AngⅡ誘導的人臍靜脈內皮細胞iNOS表達上調，卻增加內皮型NO的釋放，是否通過其他途徑增加NO釋放，還需進一步的研究，這為阿托伐他汀用于靜脈型血栓疾病的治療提供了新的思路。

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編輯/肖慧