食管鱗癌組織中Pokemon、MDM2、p53蛋白表達(dá)變化及意義

姜海斌，李超，趙云霞，韓雙雙，宋翔，劉德華，于衛(wèi)芳

(1承德市中心醫(yī)院，河北承德067000；2河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院)

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食管鱗癌組織中Pokemon、MDM2、p53蛋白表達(dá)變化及意義

姜海斌1，李超2，趙云霞2，韓雙雙2，宋翔2，劉德華2，于衛(wèi)芳2

(1承德市中心醫(yī)院，河北承德067000；2河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院)

目的 觀察食管鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)組織中POK紅系髓性致癌因子(Pokemon)、小鼠雙微體基因(MDM2)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p53蛋白的表達(dá)變化，并探討其意義。方法 取62例食管鱗癌患者術(shù)中切除食管鱗癌組織62例份為觀察組，癌旁正常食管黏膜組織(均距離癌組織邊緣5 cm以上)35例份為對照組。采用免疫組化方法檢測兩組腫瘤組織Pokemon、MDM2、p53蛋白，分析其與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果 觀察組、對照組Pokemon蛋白的陽性表達(dá)率分別為67.74%(42/62)、42.86%(15/35)，兩組相比，P<0.05；MDM2蛋白的陽性表達(dá)率分別為54.84%(34/62、28.57%(10/35)，兩組相比，P<0.05；p53蛋白陽性表達(dá)率分別為72.58%(45/62)、17.14%(6/35)，兩組相比，P<0.01。Pokemon、MDM2蛋白表達(dá)與食管鱗癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，而與性別、年齡及腫瘤是否侵及纖維膜無關(guān)(P均>0.05)；p53蛋白表達(dá)與食管鱗癌分化程度、腫瘤是否侵及纖維膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P均<0.05)，而與患者性別、年齡無關(guān)(P均>0.05)。Spearman相關(guān)分析顯示，食管鱗癌組織中Pokemon與MDM2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.599,P<0.01)；Pokemon與p53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.501,P<0.01)；MDM2與p53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.359,P<0.01)。結(jié)論 食管鱗癌患者癌組織Pokemon、MDM2、p53蛋白高表達(dá)。Pokemon、MDM2、p53蛋白的表達(dá)與食管鱗癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)。

食管鱗狀細(xì)胞癌；紅系髓性致癌因子；小鼠雙微體基因；轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子p53

食管癌是中國居民的常見惡性腫瘤，多年來其發(fā)病率和死亡率居高不下，嚴(yán)重威脅人民生命健康[1]。中國居民食管癌的病理組織學(xué)類型主要為鱗狀細(xì)胞癌(鱗癌)，占90%以上。目前，應(yīng)用單一腫瘤標(biāo)志物對于食管鱗癌的早期診斷價值有限。POK紅系髓性致癌因子Pokemon是由ZBTB7基因編碼的原癌基因，能通過分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控一些癌基因或抑癌基因的表達(dá)[2,3]。MDM2為小鼠雙微體基因，可編碼一種鋅指蛋白，與p53蛋白結(jié)合后發(fā)揮抑制p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性和阻止p53誘導(dǎo)的凋亡作用，發(fā)揮癌基因作用[4]。p53基因是人類腫瘤相關(guān)性最高的抑癌基因，超過50%的人類腫瘤組織中存在p53基因表達(dá)異常，其可通過調(diào)控DNA修復(fù)、細(xì)胞周期停滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來抑制惡性腫瘤生長[5,6]。本研究觀察了食管鱗癌組織與正常食管黏膜組織Pokemon、MDM2、p53蛋白的表達(dá)情況及與臨床病理特征之間的關(guān)系，探討三者在食管鱗癌發(fā)病過程中的作用及臨床意義，旨在為食管鱗癌的早期診斷和預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2010年1月～2014年12月間在河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院行擇期手術(shù)治療的62例食管鱗癌患者，其中男39例、女23例，年齡48～75(63.1±5.7)歲。高分化10例，中分化28例，低分化24例；腫瘤侵及纖維膜36例，未侵及纖維膜26例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移38例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期42例、Ⅲ+Ⅳ期20例。術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療和其他抗腫瘤相關(guān)治療，臨床病理資料完整。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前均未進(jìn)行放療、化療和其他抗腫瘤相關(guān)治療，臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：食管腺癌患者，術(shù)前進(jìn)行放療、化療和其他抗腫瘤相關(guān)治療，臨床病理資料不完整。62例患者均行手術(shù)切除腫瘤，取術(shù)中切除食管鱗癌組織62例份為觀察組，其中35例患者的癌旁正常食管黏膜組織(均距離癌組織邊緣5 cm以上)35例份為對照組。全部診斷均由兩位高年資病理醫(yī)師驗(yàn)證。本研究獲得河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 兩組腫瘤組織中Pokemon、MDM2、p53蛋白檢測 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。采用免疫組化SP法染色，檸檬酸緩沖液煮沸修復(fù)，嚴(yán)格按照免疫組化試劑盒說明書步驟進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，以已知陽性組織切片作陽性對照，以PBS液代替一抗作陰性對照，Pokemon抗體滴度為1∶40。濃縮兔抗人Pokemon多克隆抗體購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司，小鼠抗人MDM2單克隆抗體工作液、兔抗人p53單克隆抗體工作液、免疫組化試劑盒、濃縮型DAB試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用雙盲法顯微鏡下觀察結(jié)果，每張切片隨機(jī)取5個400倍視野。Pokemon蛋白為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色，MDM2蛋白和p53蛋白為細(xì)胞核染色，淡黃色為陽性，不著色為陰性。陽性判定以陽性細(xì)胞百分比及細(xì)胞著色程度綜合判定[6]。按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞百分比≤5%計(jì)0分、6%～25%計(jì)1分、陽性細(xì)胞百分比26%～50%計(jì)2分、陽性細(xì)胞百分比≥51%計(jì)3分；按細(xì)胞著色程度計(jì)分：細(xì)胞不著色計(jì)0分、著色為淡黃色計(jì)1分、著色為棕黃色計(jì)2分、著色為棕褐色計(jì)3分。上述兩分之和，≤3分判為陰性、>3分判為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組、對照組Pokemon蛋白陽性表達(dá)率分別為67.74%(42/62)、42.86%(15/35)，兩組比較，χ2=5.717，P<0.05；MDM2蛋陽性表達(dá)率分別為54.84%(34/62)、28.57%(10/35)，兩組比較，χ2=6.228，P<0.05；p53蛋白陽性表達(dá)率分別為72.58%(45/62)、17.14%(6/35)，兩組相比，χ2=27.575，P<0.01。

Pokemon、MDM2、p53蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1。Pokemon蛋白表達(dá)與食管鱗癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(χ2值分別為4.356、6.995、5.411，P均<0.05)，而與患者的性別、年齡及腫瘤是否侵及纖維膜無關(guān)(χ2值分別為0.056、0.520、0.789，P均>0.05)；MDM2蛋白表達(dá)與食管鱗癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期明顯相關(guān)(χ2值分別為6.427、4.045、4.406，P均<0.05)，而與患者的性別、年齡及腫瘤是否侵及纖維膜無相關(guān)性(χ2值分別為0.537、0.511、0.018，P均>0.05)；p53蛋白表達(dá)與食管鱗癌的分化程度、是否侵及纖維膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(χ2值分別為4.380、4.987、4.380、5.756，P均<0.05)，而與患者的性別、年齡無關(guān)(χ2值分別為0.996、0.063，P均>0.05)。

表1 Pokemon、MDM2、p53蛋白表達(dá)與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

Spearman等級相關(guān)分析顯示，食管鱗癌組織中Pokemon與MDM2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.599,P<0.01)；Pokemon與p53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.501,P<0.01)；MDM2與p53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.359,P<0.01)。

3 討論

研究表明Pokemon→ARF→MDM2→ p53通路在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，即Pokemon蛋白可通過阻止細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和癌性轉(zhuǎn)化，特異性地抑制腫瘤抑制蛋白ARF及其激動劑而發(fā)揮致癌作用[7]。文獻(xiàn)報道，Pokemon蛋白在小細(xì)胞肺癌[8]、鼻咽癌[9]、大腸癌[10]、胃癌[11]等多種惡性腫瘤組織中的表達(dá)顯著增高。目前，關(guān)于Pokemon蛋白與食管鱗癌發(fā)病關(guān)系的研究較少。本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組織Pokemon蛋白表達(dá)顯著高于食管正常黏膜，提示Pokemon蛋白在食管鱗癌發(fā)病過程中發(fā)揮作用，與馬莉等[12]研究結(jié)果一致。Pokemon蛋白表達(dá)與食管鱗癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯相關(guān)，而與患者的性別、年齡及腫瘤是否侵及纖維膜無關(guān)，提示Pokemon蛋白在判斷食管鱗癌的惡性程度、預(yù)后方面存在一定的臨床價值。張健等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Pokemon蛋白表達(dá)與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯相關(guān)，與本研究結(jié)論相近；Pokemon蛋白表達(dá)與分化程度無關(guān)，與本研究結(jié)論相左，考慮可能與病例數(shù)量偏少及分組不同有關(guān)，需增加病例數(shù)量進(jìn)一步研究。

MDM2基因?yàn)榘┗颍D(zhuǎn)錄的MDM2蛋白可與野生型p53蛋白酸性活化域直接結(jié)合，形成MDM2-p53復(fù)合物，能降低野生型p53轉(zhuǎn)錄活性，使其喪失抑癌功能，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[4]。本研究結(jié)果顯示，MDM2蛋白在食管鱗癌組織的表達(dá)顯著高于食管正常黏膜組織，提示MDM2蛋白在食管鱗癌發(fā)病過程中發(fā)揮作用。李靈敏等[14]研究發(fā)現(xiàn)，MDM2在正常食管黏膜、不典型增生食管黏膜、食管鱗癌組織中的表達(dá)呈明顯上升趨勢，與本組研究結(jié)果相近。MDM2蛋白表達(dá)與食管鱗癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯相關(guān)，而與患者的性別、年齡及是否侵及纖維膜無關(guān)，提示MDM2蛋白有潛力成為食管鱗癌早期診斷和評估預(yù)后的指標(biāo)。李靈敏等[14]提出，MDM2蛋白表達(dá)與食管鱗癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與本研究結(jié)論一致。Chai等[15]在食管鱗癌患者血清中檢測出MDM2蛋白，且高于正常患者組，提示其有望成為食管鱗癌腫瘤標(biāo)志物。

p53是重要的抑癌基因。體內(nèi)正常存在的野生型p53有抑制細(xì)胞癌變的作用，而突變型p53則可促進(jìn)細(xì)胞癌變。本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組織p53蛋白表達(dá)顯著高于癌旁正常食管黏膜組織，提示突變型p53蛋白在食管鱗癌組織中占主導(dǎo)優(yōu)勢。p53蛋白表達(dá)與食管鱗癌分化程度、是否侵及纖維膜、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯相關(guān)，與患者性別、年齡無明顯相關(guān)性，提示突變型p53蛋白參與食管鱗癌浸潤生長及轉(zhuǎn)移，影響患者預(yù)后。沈鴻彬等[16]研究發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中突變型p53蛋白表達(dá)陽性率明顯高于正常食管組織，突變型p53蛋白表達(dá)與食管鱗癌的分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、癌浸潤深度相關(guān)，與本研究結(jié)果一致。羅永富[17]研究發(fā)現(xiàn)突變型p53陽性表達(dá)率越高，患者的5年生存率越低，預(yù)后越差，證實(shí)基因突變與食管癌預(yù)后相關(guān)。進(jìn)一步提示突變型p53對于食管鱗癌的早期診斷與預(yù)后存在判斷價值。

本研究結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中Pokemon、MDM2和p53蛋白表達(dá)互為正相關(guān)，進(jìn)一步佐證了三者作為Pokemon→ARF→MDM2→ p53致癌通路上的重要環(huán)節(jié)，在食管鱗癌的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。朱迎春等[18]研究結(jié)果顯示人結(jié)腸癌細(xì)胞中Pokemon蛋白表達(dá)與p53蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與本研究結(jié)果不符，考慮在不同病理類型的惡性腫瘤中，Pokemon和p53蛋白發(fā)揮的作用可能并非通過上述單一通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，也可能存在其他通路的相互影響，或與本研究測定的p53主要為突變型有關(guān)。

綜上所述，食管鱗癌組織中Pokemon、MDM2、p53蛋白高表達(dá)。三者在食管鱗癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，有可能成為食管鱗癌早期診斷和評估預(yù)后的指標(biāo)。通過各種途徑調(diào)控食管鱗癌組織中Pokemon、MDM2、p53蛋白表達(dá)水平可能是治療食管鱗癌的新途徑。

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河北省科技惠民計(jì)劃課題(14277752D)；河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題計(jì)劃(20160298)。

于衛(wèi)芳(E-mail: ydyynjzx@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.016

R735

B

1002-266X(2016)39-0050-03

2016-04-13)