晚期非小細(xì)胞肺腺癌患者鉑類藥物化療前后血清表皮生長因子受體基因型變化

馬新宇，魏媛，馬笛，鞏平

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832002)

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晚期非小細(xì)胞肺腺癌患者鉑類藥物化療前后血清表皮生長因子受體基因型變化

馬新宇，魏媛，馬笛，鞏平

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆石河子832002)

目的 觀察晚期非小細(xì)胞肺腺癌患者鉑類藥物化療前后血清表皮生長因子受體(EGFR)基因型變化。方法 40例晚期非小細(xì)胞肺腺癌患者均采用鉑類藥物化療方案化療4周期，檢測患者化療前后血清EGFR基因型，檢測突變型和野生型基因比例。結(jié)果 40例患者中失訪1例，DNA提取失敗1例，最終納入38例。化療前EGFR基因型為野生型21例、突變型17例；化療后分別為19、19例。化療前后患者血清EGFR基因型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。化療前后基因狀態(tài)一致者26例，基因狀態(tài)不一致者12例，其中EGFR基因由突變型轉(zhuǎn)為野生型5例、由野生型轉(zhuǎn)為突變型7例。結(jié)論 鉑類藥物化療可導(dǎo)致晚期非小細(xì)胞肺腺癌患者EGFR基因型改變。

非小細(xì)胞肺腺癌；表皮生長因子受體；基因突變；藥物療法

肺癌是當(dāng)今世界最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率居惡性腫瘤首位。其中非小細(xì)胞肺癌占全部肺癌的80%～85%左右[1]。表皮生長因子受體(EGFR)是上皮生長因子(EGF)細(xì)胞增殖和信號傳導(dǎo)的受體，屬于ErbB受體家族的一種，在細(xì)胞生理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[2]。既往研究[3]發(fā)現(xiàn)，肺癌的發(fā)生發(fā)展中常出現(xiàn)EGFR基因突變常可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為發(fā)生改變。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)指南[4]建議EGFR突變陽性(由野生型轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃?的非小細(xì)胞肺癌患者一線治療首選表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs) ，而EGFR基因突變陰性(野生型)患者的治療以化療為主。目前EGFR基因突變陰性患者的最佳二線治療方案仍無定論[5]。有學(xué)者[6]認(rèn)為，EGFR-TKIs可作為EGFR基因突變陰性患者的二線治療方案，治療晚期肺腺癌效果較好。但目前關(guān)于非小細(xì)胞肺腺癌患者鉑類藥物化療后EGFR基因型變化的相關(guān)報(bào)道較少。本研究觀察了晚期非小細(xì)胞肺腺癌患者鉑類藥物化療前后血清EGFR基因型變化，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年8月～2015年6月就診于石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院的晚期非小細(xì)胞肺腺癌患者40例，其中男25例、女13例，年齡47～74歲，中位年齡60歲。存在吸煙史者20例；不吸煙者(不吸煙或每年吸煙<20支)18例。均經(jīng)組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診為非小細(xì)胞肺腺癌；臨床分期ⅢB～Ⅳ期；40例患者均予鉑類藥物化療：第1、2天靜脈滴注順鉑75 mg/m2、奈達(dá)鉑 80 mg/m2、卡鉑(根據(jù)肌酐值計(jì)算AUC給藥量)，21 d為1個(gè)療程，共治療2個(gè)療程。根據(jù)RECIST1.1實(shí)體瘤療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[7]評價(jià)患者療效，分為完全緩解 0例、 部分緩解 6例 、疾病穩(wěn)定 21例、疾病進(jìn)展11例。 本研究已通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核。所有入組患者均知情同意且簽署知情同意書。

1.2 患者血清EGFR基因型檢測 治療前后分別采集入試者靜脈血5 mL,2 h內(nèi)提取血清。采用PCR及直接測序法檢測40例晚期非小細(xì)胞血清EGFR基因型。按QIAampBloodMinKit試劑盒(德國Qiagen公司)說明書提取樣本DNA，利用NanoDrop檢測樣本DNA的濃度和純度。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫檢索得到人EGFR基因序列，設(shè)計(jì)EGFR外顯子19和21引物，經(jīng)NCBIBLAST同源性檢索后，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列見表1。 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送北京華大基因完成測序，使用CHROMAS軟件進(jìn)行閱讀。EGFR基因外顯子19和21片段突變結(jié)果判定：EGFR基因19外顯子突變?yōu)槿笔蛔儯瑴y序結(jié)果行NCBIBLAST與野生序列進(jìn)行對比，若測得序列與野生型序列吻合且無套疊樣峰圖，判定為野生型；若表現(xiàn)為一段序列缺失或?yàn)橐吧团c突變型套疊樣峰圖，判定為突變型。EGFR 基因21外顯子突變?yōu)長858R突變，若所測得結(jié)果與野生型序列吻合且無套疊樣峰圖，判定為野生型；若為單一T/G突變或表現(xiàn)為T/G套疊樣峰圖，判定為突變型。計(jì)算治療前后基因突變率。基因突變率=突變型例數(shù)/(突變型+野生型例數(shù))。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 EGFR基因外顯子19及21擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

40例患者中失訪1例，DNA提取失敗1例，最終納入38例。化療前EGFR基因型為野生型21例、突變型17例；化療后分別為19、19例。化療前后患者血清EGFR基因型比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。化療前后基因狀態(tài)一致者26例，基因狀態(tài)不一致者12例，其中EGFR基因由突變型轉(zhuǎn)為野生型5例、由野生型轉(zhuǎn)為突變型7例。

3 討論

非小細(xì)胞肺癌是肺癌的常見病理類型。近年來腺癌發(fā)病率逐年上升，目前已超過鱗癌，成為非小細(xì)胞肺癌的主要病理類型。EGFR是一種酪氨酸激酶型受體，EGFR基因突變與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。約一半初診肺腺癌患者可檢測到EGFR基因突變，且在治療過程中患者基因狀態(tài)可能發(fā)生改變，其中19、21外顯子突變?yōu)镋GFR基因突變的主要類型。Sordella等[8]報(bào)道，突變的EGFR基因可選擇性活化Akt及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活轉(zhuǎn)錄信號途徑STAT活化因子，從而延長細(xì)胞生存期，用小干擾RNA敲除突變的EGFR或用STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)藥理阻滯劑處理，可使非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞廣泛發(fā)生凋亡，而這些細(xì)胞能相對較好的耐受普通化療藥物所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。可見突變EGFR基因可選擇性的轉(zhuǎn)變非小細(xì)胞肺癌所依賴的經(jīng)典生存信號途徑，從而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性改變。

非小細(xì)胞肺癌早期發(fā)現(xiàn)率低于20%，晚期患者占80%以上，晚期非小細(xì)胞肺癌患者僅可行化療或加局部放療。化療應(yīng)用范圍廣泛，僅需常規(guī)病理分型即可進(jìn)行治療，但化療的低選擇性導(dǎo)致其伴隨的骨髓毒性、腎毒性、胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)明顯，且效果并不理想，有效率僅30%～40%,中位總生存期約10個(gè)月，1年生存率不到40%。近年來生物靶向治療成為非小細(xì)胞肺癌研究熱點(diǎn)，以EGFR-TIKs療效最為突出，靶向治療有更高的選擇性，療效確切，不良反應(yīng)小。但該類靶向藥物治療對EGFR基因型野生型患者無效，僅對突變型患者療效好。

目前臨床檢測EGFR基因型主要是檢測腫瘤組織，二次取材難度高，風(fēng)險(xiǎn)大，在臨床難以獲取。有研究表明[9]，實(shí)體腫瘤形成和發(fā)展過程中常有癌細(xì)胞在血循環(huán)中凋亡并釋放遺傳物質(zhì)入血。幾項(xiàng)較大樣本的研究[10]均發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者外周血與組織中EGFR基因型檢測結(jié)果一致性好，提示可以用外周血游離DNA進(jìn)行EGFR基因型的檢測。外周血EGFR基因型檢測對患者創(chuàng)傷小，風(fēng)險(xiǎn)低，臨床標(biāo)本易于獲得，并且檢測成本低。本研究結(jié)果顯示，鉑類藥物化療前后部分患者EGFR基因型發(fā)生改變。雖然化療前后患者EGFR基因突變率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但有31.6%(12/38)的患者EGFR基因狀態(tài)發(fā)生改變，12例發(fā)生改變的患者中5例由突變型轉(zhuǎn)變?yōu)橐吧停?例野生型轉(zhuǎn)變?yōu)橥蛔冃汀?/p>

鉑類為細(xì)胞周期非特異性細(xì)胞毒性藥物，其主要作用靶點(diǎn)是DNA，鉑類進(jìn)入細(xì)胞后會發(fā)生水化，進(jìn)而與DNA交聯(lián)，導(dǎo)致癌細(xì)胞DNA無法正常復(fù)制，繼而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。這是鉑類藥物引起細(xì)胞毒性的主要機(jī)制，但該過程中常常會產(chǎn)生鉑類耐藥。Nie等[9]研究發(fā)現(xiàn)，對具有EGFR基因19外顯子突變的NSCLC細(xì)胞系(PC9細(xì)胞)進(jìn)行鉑類耐藥處理的同時(shí)，其對EGFR-TKIs的敏感性降低。該研究提示鉑類藥物可能會在破壞NSCLC細(xì)胞DNA復(fù)制的同時(shí)激活其DNA修復(fù)系統(tǒng)，導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞基因發(fā)生改變，進(jìn)而使其生物學(xué)行為改變，對EGFR-TKIs敏感性降低。并且在臨床治療中發(fā)現(xiàn)，部分EGFR基因野生型患者在一線鉑類化療失敗后使用EGFR-TKIs治療可臨床獲益。本研究結(jié)果證實(shí)了鉑類藥物化療會導(dǎo)致患者EGFR基因狀態(tài)的改變，但從目前的研究結(jié)果來看，其誘導(dǎo)基因狀態(tài)發(fā)生改變的方向并不確定，在何種條件下更易誘導(dǎo)出突變型EGFR基因尚需后續(xù)的研究探索。

本研究中部分患者化療前組織EGFR基因檢測為陽性，外周血游離DNA EGFR基因檢測為陰性，但在化療后外周血游離DNA檢測轉(zhuǎn)為陽性，該現(xiàn)象的產(chǎn)生可能是由于EGFR基因突變陽性的腫瘤細(xì)胞對化療更加敏感而被大量殺滅，釋放更多DNA入血所致。該現(xiàn)象同時(shí)表明使用外周血游離DNA檢測EGFR基因狀態(tài)具有一定的局限性，即本方法可能會產(chǎn)生假陰性結(jié)果。其主要原因?yàn)橥庵苎坞xDNA含量低，受患者個(gè)體差異影響大，提取過程中對操作要求高，敏感度可能受檢測人員技術(shù)影響，故其說服力尚無法替代組織標(biāo)本[11，12]。若具有更高敏感性且易于操作的實(shí)驗(yàn)方法得以開發(fā)，則外周血游離DNA檢測EGFR基因狀態(tài)有望使用于臨床病理學(xué)診斷，造福于患者。

綜上所述，鉑類藥物化療可導(dǎo)致晚期非小細(xì)胞肺腺癌患者血清EGFR基因型改變。本研究尚存在樣本量過小等不足，今后將開展多中心大樣本量的臨床實(shí)驗(yàn)，為晚期肺腺癌患者的臨床治療提供新的思路及理論依據(jù)。

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新疆石河子大學(xué)重大科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(gxjs2013-zdgg07)。

鞏平(E-mail: 18999536479@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.014

R734

B

1002-266X(2016)39-0044-03

2015-12-17)