葡萄球菌A蛋白-聚乙烯亞胺交聯物的制備及其理化特性觀察

劉云，劉曉芬，翟源慧，張萃，劉曉波

(1川北醫學院基礎醫學院，四川南充637000；2廣東藥科大學基礎學院)

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葡萄球菌A蛋白-聚乙烯亞胺交聯物的制備及其理化特性觀察

劉云1，劉曉芬2，翟源慧2，張萃2，劉曉波2

(1川北醫學院基礎醫學院，四川南充637000；2廣東藥科大學基礎學院)

目的 制備葡萄球菌A蛋白-聚乙烯亞胺交聯物(SPA-PEI交聯物)，并觀察其理化性狀。方法 采用異型雙功能交聯劑N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)化學偶聯法將葡萄球菌A蛋白(SPA)與聚乙烯亞胺(PEI)化學交聯，用SephadexG75柱層析法純化SPA-PEI交聯物。采用SDS-PAGE法鑒定交聯物的純度；紫外分光光度法測定交聯物的吸收峰；采用粒度及Zeta電位分析儀測定交聯物的粒徑及表面Zeta電位、酸堿滴定法測定交聯物的質子緩沖能力。 結果 SPA與PEI共價結合形成SPA-PEI交聯物，且交聯物的純度較高。SPA-PEI交聯物在280 nm處有一吸收峰，其吸收曲線與SPA類似。SPA-PEI交聯物粒徑為(185.0±28.5)nm，表明Zeta電位為(38.0±6.6)mV，提示其粒徑范圍合理，帶有較強的正電荷，可結合帶負電荷的核酸片段。SPA-PEI交聯物的酸堿滴定曲線與PEI類似，均有一個明顯的緩沖平臺，提示該交聯物具有較強的質子緩沖能力。結論 成功地制備出純度良好的SPA-PEI交聯物。SPA-PEI交聯物粒度分布較合理、表面帶較強正電荷、并且具有較強的質子緩沖能力。

葡萄球菌A蛋白；聚乙烯亞胺；N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯；化學交聯；核酸轉移系統；吸收峰；粒徑；Zeta電位；質子緩沖能力

非病毒型核酸轉移載體具有安全性高、制備簡便等特性，其中聚乙烯亞胺(PEI)尤為引人注目。PEI是一類多聚陽離子聚合物,帶有強大正電荷，能通過靜電作用與DNA片段結合，并包裹壓縮DNA分子成球狀而容易進入細胞,因此可作為核酸轉移載體。PEI攜帶豐富氨基，由于其“質子海綿效應”易使攜帶的DNA逃脫溶酶體酶破壞而較多聚賴氨酸(PLL)等其他陽離子聚合物更高的基因表達效率，因此PEI被視為最有前途的非病毒核酸轉移載體之一[1，2]。然而單純PEI作為核酸轉移載體卻有重大缺陷，即無細胞組織特異性或靶向性，這也是目前非病毒型核酸載體研究中需要解決的關鍵問題。抗體是最常用的靶向性物質，具有獨特的優勢[3，4]。以特異性抗體作為靶向物質構建抗體-聚乙烯亞胺核酸載體，是PEI載體具有靶向性或特異性的重要途徑。然而抗體與PEI的直接化學交聯存在著步驟繁多、抗體活性易受損傷等問題[5，6]。葡萄球菌A蛋白(SPA)是一種性能穩定的小分子蛋白，能與IgG抗體以高親和力、非共價迅速結合[5]。筆者設想，先將SPA與PEI形成葡萄球菌A蛋白-聚乙烯亞胺交聯物(SPA-PEI交聯物)，再將IgG抗體與SPA-PEI交聯物混合即可形成抗體-聚乙烯亞胺靶向載體，其組成形式為Ab/SPA-PEI，將該載體與核酸結合即可構建成一種新型的抗體靶向性核酸轉移系統，可特異性或靶向性轉移核酸進入組織細胞中。這種核酸轉移系統由三部分構成：IgG抗體、SPA-PEI交聯物和核酸片斷，其中SPA-PEI交聯物起著“橋梁”或“接頭”作用，為該抗體靶向性核酸轉移系統的關鍵組分。2015年12月～2016年6月，我們采用異型雙功能交聯劑N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶二硫基)丙酸酯(SPDP)將SPA與PEI進行共價交聯，并對所得SPA-PEI交聯物的純度、紫外光吸收峰、粒徑、Zeta電位及質子緩沖能力等物理化學性質進行了觀察?，F報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPA(分子量約為20 kD)、PEI(分子量為25 kD)、SPDP為Sigma公司產品；二硫蘇糖醇(DTT)為廣州威佳科技有限公司產品；凝膠過濾填料SephadexG75為Pharmacia公司產品。紫外可見光分光光度計(UV2201型)、粒度及Zeta電位分析儀(Zetasizer Nano ZS90型)為Malvern公司產品。

1.2 SPA與PEI的化學交聯 采用SPDP化學偶聯法，按文獻[5,7]方法進行。大致步驟：①PEI-PDP、SPA-PDP的制備。將經PBS透析的 PEI或SPA按1∶2摩爾比與SPDP混合,室溫下作用60 min后,經PBS透析獲得純化PEI-PDP或SPA-PDP；②PEI-PDP還原生成PEI-SH。將經0.1 mol/L醋酸緩沖液(pH4.5) 透析的PEI-PDP與 DTT混合，于室溫下作用30 min后同上經PBS透析，獲得純化的PEI-SH；③PEI-SH與SPA-PDP反應生成SPA-PEI交聯物。將等量PEI-SH與SPA-PDP混合后于室溫下攪拌22 h,獲得含有SPA-PEI交聯物的混合物。

1.3 SPA-PEI交聯物的純化 按文獻[5]方法，采用SephadexG75柱層析法進行純化。收集合并第一峰液體即為純化SPA-PEI交聯物，將合并的液體置于透析袋中用聚乙二醇濃縮至適當體積，過濾除菌，于4℃保存。

1.4 SPA-PEI交聯物的理化特性觀察 ①紫外吸收峰:將SPA-PEI交聯物、SPA和PEI溶于PBS溶液(pH值7.5)，終濃度分別為0.25、0.50、0.75 mg/mL,于200～400 nm波長范圍內測定吸光度值(A值)，觀察紫外吸收峰的波長。②純度:采用SDS-PAGE法鑒定SPA-PEI交聯物的純度。按常規方法進行SDS-PAGE電泳、染色和脫色等。樣品的處理采用非還原型和還原型方法(1 mol/L DTT作用10 min)。觀察電泳條帶分布。③粒徑和Zeta電位:按文獻[8]方法進行。將SPA-PEI交聯物或PEI溶于去離子水中，配成濃度1 mg /mL，采用粒度及Zeta電位分析儀測定樣品的表面電荷和粒徑(重復測定3次)。④質子緩沖能力:按文獻[8，9]方法，采用酸堿滴定法測定。將PEI或SPA-PEI交聯物溶解于蒸餾水中，配成濃度1mg/ml溶液。以4 mol/L NaOH液調節pH至12，然后以1 mol/L HCl液滴定(每次滴加直至pH=2)；以pH計測定。

2 結果

2.1 SPA-PEI交聯物的制備結果 SPA-PDP與PEI-SH的反應混合物用Sephadex G75層析柱洗脫純化，獲得3個蛋白峰，首峰是SPA-PEI交聯物。

2.2 SPA-PEI交聯物的理化特性 ①紫外吸收峰:SPA-PEI交聯物、SPA、PEI在210 nm處有最大光吸收峰；SPA-PEI交聯物、SPA在280 nm處有一小吸收峰，而PEI沒有。②純度：SPA-PEI交聯物經DTT處理后行SDS-PAGE電泳，可見在分子量約20 kD處出現一蛋白條帶，與單獨SPA電泳條帶位置一致，而未經還原劑DTT處理的SPA-PEI交聯物無條帶出現。提示SPA-PEI交聯物純度較高，無游離的SPA等其他組分存在。③粒徑和表面Zeta電位:SPA-PEI交聯物粒徑為(185.0±28.5)nm，位于多數體內外轉染用的轉染試劑粒徑范圍內；表面Zeta電位為(38.0±6.6)mV，帶有較強的正電荷，應能與負電荷的核酸靜電結合。④質子緩沖能力:在pH 3～8范圍內，PEI和SPA-PEI交聯物滴定曲線均有一個明顯的緩沖平臺，而蒸餾水沒有，提示SPA-PEI交聯物和PEI具有較強緩沖能力，但PEI強于SPA-PEI交聯物。

3 討論

SPDP是一種異型雙功能交聯劑，具有兩個活性基團：N-羥基琥珀酰亞胺基和吡啶二硫基，通過這兩個基團能將具有伯氨基的化合物，如蛋白等共價交聯。其原理[5,7]：SPDP通過琥珀酰亞胺基分別與蛋白質分子的伯氨基反應，引入吡啶二硫基(-PDP)，形成蛋白-PDP；將DTT等還原劑與其中之一的蛋白-PDP反應，使其吡啶二硫基被還原成-SH，生成蛋白-SH；蛋白-PDP與蛋白-SH混合發生巰基-二硫基交換而使兩種蛋白質交聯。SPDP交聯法具有反應條件溫和、反應專一、回收率高、不易發生蛋白質自身的交聯、所獲得的交聯物活性良好等優點[5,7]。許多研究者采用SPDP作為交聯劑成功地將SPA或PEI與多種活性蛋白交聯，如SPA與辣根過氧化物酶(HRP)[10]、PEI與多肽[11]等交聯。本項目組以SPDP為交聯劑，成功地將抗體與人血清白蛋白納米微球、SPA與多聚賴氨酸(PLL)、鏈球菌G蛋白(SPG)與PEI共價交聯，交聯物仍保持了抗體、SPA或SPG等蛋白的活性[5，12～14]。本研究也以SPDP為交聯劑，成功地將SPA與PEI共價交聯制備了SPA-PEI交聯物。SPA-PEI交聯物、SPA、PEI在210 nm處有最大光吸收峰；SPA-PEI交聯物、SPA在280 nm處有一小吸收峰，而PEI沒有。SPA-PEI交聯物經DTT處理后行SDS-PAGE電泳，可見在分子量約20 kD處出現一蛋白條帶，與單獨SPA電泳條帶位置一致，而未經還原劑DTT處理的SPA-PEI交聯物無條帶出現。提示SPA-PEI交聯物純度較高，無游離的SPA等其他組分存在。

SPA是來源于金黃色葡萄球菌細胞壁的一種蛋白，具有多種優點[5]：分子量小、易制備純化、易保存；能與多種IgG抗體以高親和力，非共價迅速結合，且結合過程受溫度影響較小。目前SPA除用于免疫學診斷和抗體的純化外，還用于基于抗體的親和層析。本項目組曾將SPA與PLL共價交聯，制備SPA-PLL交聯物用于抗體靶向性核酸轉移系統的構建，獲得成功[5,6]。本研究將SPA與PEI共價交聯制備了SPA-PEI交聯物，希望借助PEI具有“質子海綿效應”等多種優點，以實現靶向性導入的核酸能獲得更有效地轉染和表達。

PEI與其他多聚陽離子聚合物相比基因表達效率更高[1～3，8,12]，本研究結果顯示，PEI雖然與SPA共價結合形成SPA-PEI交聯物，但該交聯物的粒徑、表面電荷仍與游離PEI類似，并且仍具有較強的質子緩沖能力，提示但該交聯物能結合核酸片段，具有較高的轉染和表達效率。

SPA-PEI交聯物的抗體靶向性核酸轉移系統構建具有以下特點：①以SPA為“橋”，Ab與PEI非共價結合起來，可以避免抗體的化學交聯；②簡便有效，節約成本,將IgG抗體與SPA-PEI交聯物經簡單地混合即可；③SPA-PEI交聯物具通用性，易標準化。只要制備出一種SPA-PEI交聯物，就可與多種IgG類的特異性抗體結合，組裝多種特異性抗體-聚乙烯亞胺靶向性核酸載體。本研究既為構建抗體-PEI靶向基因載體提供實驗基礎，也有利于為以后的靶向性基因轉染和基因治療提供新型的非病毒型基因載體。

[1] Boussif O，Lezeoualch F， Zanta M， et al． A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethyleneimine[J]． Proc Natl Acad Sci U S A,1995，92(16):7297-7301．

[2] Jiang QY, Lai LH, Shen J, et al. Gene delivery to tumor cells by cationic polymeric nanovectors coupled to folic acid and the cell penetrating peptide octaarginin[J]. Biomaterials，2011，32(29):7253-7262．

[3] 劉曉芬，劉曉波.靶向性聚乙烯亞胺作為基因載體的研究現狀[J].國際藥學研究雜志，2015,42(4)：478-482,487.

[4] Merdan T, Callahan J, Petersen H，et al. Pegylated Polyethylenimine-Fab'antibody fragment conjugates for targeted gene delivery to human ovarian carcinoma cells[J]. Bioconjugate Chem, 2003,14(5):989-996.

[5] 劉曉芬，劉云，張萃，等.一種新型抗體導向核酸轉移系統關鍵組分的制備及鑒定[J].廣東藥學院學報,2015,31(3):372-378.

[6] 劉曉波,余學清，李曉艷，等.CD44抗體靶向綠色熒光蛋白質粒導入系統的構建及其特異性轉染大鼠腎小管上皮細胞的觀察[J].中國病理生理雜志,2006,22(6):1232-1234

[7] Carlson J, Drevin H, Axen R. Protein thiolation and reversible protein-protein conjugation[J]. Biochem J, 1978,173(3):723-737.

[8] Tian H, Li F, Chen J, et al. N-Isopropylacrylamide-Modified Polyethylenimines as effective gene carriers[J]. Macromol Biosci, 2012,12(12):1680-1688.

[9] Pain D, Surolia A. Preparation of protein A-peroxidase monoconjugate using a heterobifunctional reagent, and its use in enzyme immunoassays[J]. J Immunol Methods, 1981,40(21):219-230.

[10] 劉君，虎義平，姜啟英，等.多肽MC10介導的聚乙烯亞胺-β-環糊精聚合體作為靶向Her-2受體基因載體的研究[J].浙江大學學報(醫學版),2009, 38(1):7-14.

[11] 劉曉波，蔡美英.抗人肝癌免疫毫微粒的制備及體外免疫學性質的鑒定[J].中國免疫學雜志，2000,16(5)：262-265.

[12] 王霞，劉曉波，蔡美英,等.抗體F(ab')2片段靶向的載多柔比星免疫毫微粒的構建及其抗肝癌作用[J].中國抗生素雜志，2003，28(3)：176-180.

[13] Puls RL,Minchin RF.Gene transfer and expression of a nonviral polycation-based vector in CD4+cells[J]. Gene Therapy, 1999,6(10):1774-1778.

[14] Yolken RH, Leister FJ. Staphylococcal protein A-enzyme immunoglobulin conjugates:versatile tools for enzyme immunoassays[J].J Immunol Methods,1981,43(2):209-218.

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《山東醫藥》關于醫學名詞與統計學符號的應用說明

醫學名詞要以1989年及以后由全國自然科學名詞審定委員會審定、公布，科學出版社出版的《醫學名詞》和相關科學的名詞為準，暫未公布者仍以人民衛生出版社出版的《英漢醫學詞匯》為準。中文藥物名稱應使用1995年藥典(法定藥物)或衛生部藥典委員會編輯的《藥名詞匯》(非法定藥物)中的名稱，英文藥物名稱則采用國際非專利藥名，不用商品名。

四川省教育廳自然科學重點項目(13ZA0220)；教育部留學回國人員啟動基金(教外司留[2007]1108號)。

劉曉波(E-mail： xiaobo9412@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.012

R392.33

A

1002-266X(2016)39-0039-03

2016-07-08)