補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方劑灌胃自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓及腦組織中MMP-9蛋白表達(dá)觀察

趙鐸，王丹，鄭春歡，鄭紹周

(1河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，鄭州450000；2河南中醫(yī)學(xué)院)

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補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方劑灌胃自身免疫性腦脊髓炎大鼠脊髓及腦組織中MMP-9蛋白表達(dá)觀察

趙鐸1，王丹1，鄭春歡2，鄭紹周1

(1河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，鄭州450000；2河南中醫(yī)學(xué)院)

目的 觀察補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方劑灌胃的自身免疫性腦脊髓炎大鼠 (EAE)脊髓及腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白表達(dá)變化。方法 80只大鼠隨機(jī)分為高、中、低劑量組，EAE組和空白組各16只。高、中、低劑量組和EAE組構(gòu)建急性EAE模型。高、中、低劑量組于造模第1天開始，分別予60、30、15g/kg補(bǔ)腎通絡(luò)方劑灌胃，1 次/d,共7d。EAE組予生理鹽水2mL/只灌胃，1 次/d，共7d。空白組不做任何處理。造模第15、21天記錄各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，斷頭處死后分離脊髓、腦組織，采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠脊髓、腦組織中的MMP-9蛋白。 結(jié)果 造模第15、21天，高、中、低劑量組、EAE組神經(jīng)功能評(píng)分均高于空白組，P均<0.05。造模第15天，中、高劑量組與EAE組神經(jīng)功能評(píng)分比較，P均<0.05。造模第21天，中劑量組與EAE組神經(jīng)功能評(píng)分比較，P<0.05。造模第15、21天高、中、低劑量組、EAE組脊髓、腦組織MMP-9蛋白IOD均高于空白組，P均<0.05。造模第15、21天，低、中、高劑量組與EAE組脊髓、腦組織MMP-9蛋白IOD均比較，P均<0.05。 結(jié)論 補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方劑能下調(diào)大鼠模型脊髓、腦組織MMP-9的表達(dá)。

多發(fā)性硬化；實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎；補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方劑；基質(zhì)金屬蛋白酶

多發(fā)性硬化(MS)是一種病因不明的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)脫髓鞘為特征的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與遺傳、生態(tài)環(huán)境、病原體感染以及自身免疫反應(yīng)等多種因素有關(guān)。最新研究[1]認(rèn)為MS是自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病。基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是一組鋅依賴的金屬蛋白內(nèi)切酶家族中的重要一員,MMP-9惟一的內(nèi)源性抑制劑是金屬蛋白酶組織抑制劑1(tTIMP-1)，二者之間的平衡對(duì)維持細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。近年研究發(fā)現(xiàn),MMP-9與MS的發(fā)病關(guān)系密切，是MS中神經(jīng)炎癥及血腦屏障破壞的主要參與者,在MS的發(fā)生和發(fā)展中具有重要意義。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型(EAE)[2]是目前研究MS常用的經(jīng)典動(dòng)物模型。近年研究[3]發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方劑治療MS效果較好，但其具體作用機(jī)制尚缺乏深入研究。2015年6～12月，我們觀察了補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方劑灌胃的EAE大鼠模型脊髓、腦組織MMP-9表達(dá)變化?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 清潔級(jí)健康雌性成年Wistar大鼠80只，體質(zhì)量180～220 g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號(hào)：0009367；豚鼠15只，體質(zhì)量350～450 g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心養(yǎng)殖場(chǎng)提供。補(bǔ)腎通絡(luò)方劑組成：淫羊藿30 g、巴戟天20 g、菟絲子30 g、重樓30 g、六月雪浸膏(5 g/mL×6 mL,相當(dāng)于生藥30 g)、白花蛇舌草15 g、全蝎10 g、僵蠶15 g、黃芪30 g、澤瀉30 g、川芎20 g、皂刺15 g、莪術(shù)25 g、甘草6 g。除六月雪外，余中藥采用散裝顆粒劑，每付顆粒劑加6 mL六月雪浸膏混合，溫開水稀釋，配置成濃度為6 g/mL的補(bǔ)腎通絡(luò)方劑藥液由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室提供，4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｍ耆ナ献魟?CFA)(美國(guó)Sigma公司)、百日咳桿菌原液(北京生物制品研究所)、10%水合氯醛(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)、TGL-16R冷凍高速離心機(jī)(珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司)、Olympus CHC顯微鏡(日本Olympus株式會(huì)社)。

1.2 大鼠分組及補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方劑給藥方法 80只大鼠隨機(jī)分為高、中、低劑量組，EAE組和空白組，每組16只。高、中、低劑量組和EAE組參照文獻(xiàn)[4～7]方法構(gòu)建急性EAE模型。豚鼠腹腔注射10%水和氯醛麻醉后，在冰上迅速剖開背部皮膚、暴露脊柱，剪斷枕骨大孔、第一尾椎，分離脊柱，縱向剪開椎管取出脊髓，去除脊膜，稱重后放入勻漿器，加入等量冰生理鹽水，將勻漿器放入冰水中研磨成50%的豚鼠脊髓勻漿(GPSCH)。取10 mL玻璃注射器2支，一支抽取GPSCH，另一支抽取等體積的CFA，取12號(hào)硅膠管約10 cm，緊密連接2支注射器，冰上反復(fù)抽打GPSCH 直至成為GPSCH抗原油包水乳劑。取少許油包水乳劑滴入水中，10 min未見消散即為GPSCH抗原油包水乳劑制備成功。取各組大鼠，兩足均經(jīng)足墊皮下注射0.1 mL GPSCH抗原油包水乳劑，右下肢足背部皮下注射百日咳桿菌原液0.1 mL，制作急性EAE模型。造模第1～2天出現(xiàn)四肢足墊紅腫視為造模成功。空白組不做任何處理。高、中、低劑量組于造模第1天開始，分別予60、30、15 g/kg 補(bǔ)腎通絡(luò)方劑灌胃，1 次/d, 共7 d。EAE組予生理鹽水2 mL/只灌胃， 1 次/d, 共7 d?？瞻捉M不做任何處理。

1.3 各組大鼠神經(jīng)功能觀察 分別于造模第15、21天取各組大鼠，參照文獻(xiàn)[8]方法觀察各組大鼠神經(jīng)功能，采用Kohn等[8]的5分法對(duì)各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)分:0分為大鼠未發(fā)病；1分為大鼠尾部張力下降或肢體輕度笨拙；2分為尾部張力消失、中度笨拙或姿勢(shì)維持缺乏；3分為大鼠后肢無力或部分癱瘓；4分為后肢完全癱瘓或前肢無力；5分為大鼠四肢癱瘓或?yàn)l臨死亡。

1.4 各組大鼠脊髓、腦組織MMP-9蛋白檢測(cè) 分別于造模第15、21天取各組大鼠，每組8只，斷頭處死后分離脊髓、腦組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋及制片，HE染色，采用免疫組化法檢測(cè)各組大鼠脊髓、腦組織中的MMP-9蛋白。所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。每只大鼠腦、脊髓組織切片隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野(400×)，采用IPP圖像分析軟件對(duì)各組標(biāo)本進(jìn)行定量分析，結(jié)果用積分光密度(IOD)表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組檢測(cè)結(jié)果數(shù)值資料以表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

造模第15、21天各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分見表1。造模第15、21天各組大鼠脊髓、腦組織中MMP-9蛋白IOD見表2。

表1 造模第15、21天各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較(分，

表2 造模第15、21天各組大鼠脊髓、腦組織中MMP-9蛋白IOD比較

3 討論

MS是一種免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘疾病，是以細(xì)胞免疫為主的自身免疫性疾病。炎性細(xì)胞尤其是T淋巴細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遷移和浸潤(rùn)是制作MS動(dòng)物模型的關(guān)鍵因素。EAE是一種以特異性致敏的CD4+淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的,以中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘、血腦屏障破壞及腦脊髓實(shí)質(zhì)和血管周圍單核淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自身免疫性疾病，是目前研究多MS的經(jīng)典動(dòng)物模型[2，3]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是鋅依賴的金屬蛋白內(nèi)切酶家族，參與人體正常胚胎發(fā)育和組織重塑,在正常狀態(tài)下其活性被抑制在較低水平。MMP-9為MMPs家族的一種,屬于明膠酶。國(guó)內(nèi)外多組實(shí)驗(yàn)研究[9]均觀察到，EAE發(fā)病急性期腦脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)及血管旁有大量淋巴樣炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，免疫組化結(jié)果提示提示該階段存在MMP-9高表達(dá)。MMPs幾乎涉及MS發(fā)病過程中的所有病理損傷環(huán)節(jié)，過量的MMPs持續(xù)水解蛋白也是MS神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素之一。MS患者血清MMP-9水平值顯著升高[10]，MMP-9可降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原，纖維連接蛋白及明膠等ECM,還可降解髓鞘堿性蛋白，其降解產(chǎn)物可進(jìn)一步增強(qiáng)自身免疫反應(yīng)，并造成抗原決定簇(表位)的擴(kuò)散。MMP-9水平可以作為評(píng)估MS患者血腦屏障(BBB)的破壞及預(yù)測(cè)MRI發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性病灶的可信賴指標(biāo)。有離體實(shí)驗(yàn)證明MMP-9能夠通過降解血管內(nèi)皮細(xì)胞中的基質(zhì)蛋白進(jìn)而增加微血管內(nèi)皮的通透性，同時(shí)其降解的基質(zhì)片斷對(duì)炎癥細(xì)胞有趨化作用，從而可以使T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞穿透BBB基底膜。MMP-9可以通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而促使炎性細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)擴(kuò)散。

MS屬中醫(yī)學(xué)“痿證”范疇，其次可歸屬于眩暈、青盲、骨繇、痹證等疾病，其原因責(zé)之先天不足、稟賦異常。先天不足、腎精虧虛則腦髓失養(yǎng)，內(nèi)傷之病易傷及腦髓；稟賦異常、肺衛(wèi)不固，則易受六淫與邪毒侵襲。本病多為外受濕熱毒邪侵襲，肺衛(wèi)氣虛，不能抵御外邪，導(dǎo)致濕熱毒邪傷及肌膚、直入經(jīng)絡(luò)、阻滯氣血、導(dǎo)致痰瘀阻絡(luò)；而腎精虧虛，腦髓失養(yǎng)，外感之毒邪迅速傷及腦髓，導(dǎo)致肢體痿軟、視物模糊、四肢麻木等癥狀。MS的病位在腦髓，《靈樞·海論》曰：“腦為髓之海”?！端貑枴の迮K生成》說：“諸髓者，皆屬予腦”。腎為先天之本，藏精、主骨、生髓。因此MS病位腎。毒邪是多發(fā)性硬化發(fā)病及復(fù)發(fā)的主要病理因素[11]。毒邪除外來之濕、熱、毒邪侵襲外，亦可見內(nèi)生之濕、濁、痰、瘀。MS急性發(fā)作期(發(fā)病15 d之前)邪毒侵襲人體，上犯于腦，損傷腦髓，導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，元神失養(yǎng)而肢痿不用；或濕熱蘊(yùn)藏，導(dǎo)致三焦氣化不利，津聚成痰，痰熱互結(jié)，筋脈失養(yǎng)[12]。其病機(jī)多為腎精虧虛、毒損脈絡(luò)。腎虛是MS的發(fā)病基礎(chǔ)；毒邪侵犯人體是發(fā)病的直接誘因[13]；毒損腦髓、絡(luò)脈瘀滯是造成肢體痿廢失用且遷延難愈的根本原因[14]。毒損督絡(luò)、戕害腎陽及腦髓、敗壞形體為本病的核心病機(jī)，腎精不足是其主要內(nèi)因，內(nèi)外濕熱毒邪是其主要致病因素[15]。本病的病位在腦髓，其基本病機(jī)為脾腎虧虛、痰瘀阻絡(luò)、濁毒內(nèi)蘊(yùn)；以脾腎虧虛為本，痰、瘀、濕、毒為標(biāo)，本虛尤以腎虛為著。故提出補(bǔ)腎解毒通絡(luò)法是預(yù)防性治療多發(fā)性硬化急性期的基本治法[16]。因而在治療上倡導(dǎo)益腎解毒、化濁通絡(luò)之法。故在中醫(yī)“腎藏精”、“腎生髓通于腦”經(jīng)典臟象理論的指導(dǎo)下，從腎虛邪毒入手，以補(bǔ)腎解毒通絡(luò)之法治療多發(fā)性硬化。補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方系名老中醫(yī)鄭紹周教授的經(jīng)驗(yàn)方，方中淫羊藿、巴戟天、菟絲子補(bǔ)益腎精，重樓、六月雪、白花蛇舌草清熱解毒，全蝎祛風(fēng)解毒、僵蠶疏風(fēng)通絡(luò)，黃芪補(bǔ)益中氣，澤瀉健脾顧護(hù)后天之本、川芎祛瘀通絡(luò)，皂刺、莪術(shù)搜風(fēng)通絡(luò)，甘草調(diào)和諸藥。諸藥相輔相成，共奏補(bǔ)腎益精、解毒通絡(luò)之功。本研究結(jié)果顯示，造模第15、21天，高、中、低劑量組和EAE組神經(jīng)功能評(píng)分均高于空白組。造模第15天，中、高劑量組神經(jīng)功能評(píng)分低于EAE組。造模第21天中劑量組神經(jīng)功能評(píng)分低于EAE組。造模第15、21天高、中、低劑量組和EAE組脊髓、腦組織MMP-9蛋白IOD均高于空白組。造模第15、21天低、中、高劑量組脊髓、腦組織MMP-9蛋白IOD均低于EAE組均。說明補(bǔ)腎解毒通絡(luò)方劑可明顯降低急性期、緩解期EAE大鼠脊髓、腦組織中MMP-9的表達(dá)。

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