抗結核藥物性肝損傷大鼠肝組織TUG1、NEAT1、Gas5的表達觀察

田慎謙，王悅，牛琛，李玉紅，朱凌妍，任琦，鄭國穎，馮福民

(華北理工大學公共衛生學院，河北省煤礦衛生與安全重點實驗室, 河北唐山 063000)

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抗結核藥物性肝損傷大鼠肝組織TUG1、NEAT1、Gas5的表達觀察

田慎謙，王悅，牛琛，李玉紅，朱凌妍，任琦，鄭國穎，馮福民

(華北理工大學公共衛生學院，河北省煤礦衛生與安全重點實驗室, 河北唐山 063000)

目的 觀察抗結核藥物性肝損傷(ADLI)大鼠肝組織長鏈非編碼RNA(lncRNA)TUG1、NEAT1、Gas5的表達變化。方法 56只SPF級SD大鼠隨機分為A、B、C、D、E、F組和對照組各8只，A、B、C、D、E、F組大鼠予異煙肼55 mg/kg灌胃，1 次/d,分別于給藥3、7、10、14、21、28 d時處死，對照組大鼠予等容積蒸餾水灌胃，于灌胃28 d處死。采用熒光定量PCR法檢測各組肝組織TUG1、NEAT1和Gas5，并檢測TUG1上游分子SP1及下游分子HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA。結果 各實驗組和對照組中NEAT1、Gas5比較，P均>0.05。A、B、C、D、F組TUG1相對表達量與對照組比較，P均<0.05。B、C組SP1 mRNA的相對表達量與對照組比較，P均<0.05;A、C、D組HOXB7 mRNA相對表達量與對照組比較，P均<0.05；E、F組KLF2 mRNA相對表達量與對照組比較，P均<0.05；C、D、E、F組Bcl-2 mRNA的相對表達量與對照組比較，P均<0.05；B、C、E組Caspase-3 mRNA的相對表達量與對照組比較，P均<0.05。結論 ADLI大鼠肝組織TUG1低表達，其可能通過調控HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達參與ADLI的發生、發展。

抗結核藥物性肝損傷；長鏈非編碼RNA；TUG1；NEAT1；Gas5

異煙肼是目前常用的一線抗結核藥物，但使用不當其易導致抗結核藥物性肝損傷(ADLI)[1]，最終導致結核化療方案改變、中斷,患者出現肝衰竭等不良反應，嚴重影響結核的治療及患者預后。目前ADLI的具體發病機制尚不明確[2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)在基因印記、細胞周期調控、轉錄的抑制和激活等各種生物生理活動起重要作用[3]。研究[4]發現lncRNA中的 TUG1、NEAT1、Gas5在人、大鼠、小鼠肝組織中均可表達，且在肝癌的細胞增殖、細胞凋亡、侵襲、遷移中起重要作用。病毒性肝炎、藥物性肝損傷等肝臟疾病中往往也伴隨著異常的細胞凋亡和增殖，但TUG1、NEAT1、Gas5 與ADLI的關系尚不明確。2014年9月～2016年3月，我們觀察異煙肼導致的ADLI大鼠肝臟組織中TUG1、NEAT1和Gas5變化。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 56只SPF級SD大鼠[北京華阜康生物科技公司，動物許可證號：SCXK(京)2009-0004]，8～9周齡，體質量258～365 g，雌雄各半。異煙肼(沈陽紅旗制藥有限公司，批號：1404022)，TRIpure Reagent(北京百泰克生物技術有限公司，批號：0020141224)，PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒(大連TaKaRa公司)，SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(大連TaKaRa公司)，MDA、SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所)。HITACHI 7600-020全自動生化分析儀(日本日立公司)；Heraeus高速冷凍離心機(德國Thermo Scientific公司)；C1000PCR擴增儀(美國BIO-RAD公司)；熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.2 大鼠分組及ADLI模型制備方法 56只大鼠隨機分為A、B、C、D、E、F組和對照組各8只，A、B、C、D、E、F組每天異煙肼55 mg/kg灌胃，1次/d，對照組予等容積蒸餾水灌胃，制作ADLI模型。A、B、C、D、E、F組分別于給藥第3、7、10、14、21、28天時處死大鼠，對照組于第28 天處死大鼠，取肝組織50～100 mg備用。

1.3 各組大鼠肝組織TUG1、NEAT1、Gas5檢測 采用熒光定量PCR法。取大鼠肝組織，常規TRIzol法提取總RNA，反轉錄和實時熒光定量PCR嚴格按照試劑盒說明書進行操作。以GAPDH為內參，用 2-ΔΔCt來表示各RNA的相對表達量。引物均由上海生工合成，其序列如下：TUG1上游引物5′-TACGTCCCGTGCCTCCTGAT-3′，下游引物5′-AGGGCTGTGCTGAATCTGGG-3′； NEAT1上游引物5′-ACTGCTTGACACCCCATGCC-3′，下游引物5′-CGGTGATGACCACGGCTACC-3′；Gas5上游引物5′-AGCCAGAAAATGGGATGGTGGA-3′，下游引物5′-TGTGGAGCTTGCCATGCCTT-3′； GAPDH上游引物5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，下游引物5′-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3′。反轉錄反應條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃1 min；定量PCR反應條件：95 ℃30 s，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環。

1.4 TUG1上游分子SP1及下游分子HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 的mRNA檢測 采用熒光定量PCR法檢測方法“1.3”中存在統計學差異的TUG1的上游分子SP1及其下游分子HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3、p15、p16、p27和p57 mRNA表達，所有操作均同“1.3”。引物序列如下。SP1上游引物5′-TGCAGCAGAATTGAGTCACC-3′，下游引物5′-CACAACATACTGCCCACCAG-3′；HOXB7上游引物5′-CACTACAATCGCTACCTGACTCG-3′，下游引物5′-TTCCTCCTCTTCCTCCTCGT-3′；KLF2上游引物5′-TCGCACCTAAAGGCGCATC-3′，下游引物5′-TAGTGGCGGGTAAGCTCGTC-3′；Bcl-2上游引物5′-GGGATGCCTTTGTGGAACTAT-3′，下游引物5′-AGGTATGCACCCAGAGTGATG-3′；Caspase-3上游引物5′-GGTATTGAGACAGACAGTGG-3′，下游引物5′-CATGGGATCTGTTTCTTTGC-3′。反轉錄反應條件：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃1 min；定量PCR反應條件：95 ℃30 s ，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個循環。用 2-ΔΔCt來表示各mRNA相對表達量。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料表示，組間比較采用單因素方差分析，相關性分析采用Pearson相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肝組織TUG1、NEAT1及Gas5表達比較 各組大鼠肝組織TUG1、NEAT1及Gas5表達比較見表1。

表1 各組大鼠肝組織TUG1、NEAT1和Gas5表達比較

2.2 各組大鼠肝組織SP1、HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達量 各組SP1、HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達量比較見表2。

表2 各組大鼠肝組織SP1、HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA相對表達量比較

3 討論

異煙肼毒性代謝產物主要通過與肝細胞大分子物質共價結合[5]引起肝細胞壞死和脂肪變性導致ADLI，除此之外過氧化應激反應、人體乙酰化速率、以及藥物代謝酶等均與ADLI有關。最新研究發現表觀遺傳學在ADLI的發生、發展中起重要作用。

NEAT1、Gas5 和TUG1均具有重要的調控功能。Gas5可通過負調控microRNA-21的表達，促進肝癌細胞的侵襲和轉移[4]，還可通過調控波形蛋白的表達促進細胞增殖[5]。NEAT1表達改變影響肝癌的發生和轉移，其高表達與MDTH、NM23和MALAT1有關[6]。TUG1能夠影響細胞增殖和凋亡，在很多疾病中都發揮著重要的調控功能，如肝癌[7]、胃癌[8]、肺癌[9]、骨肉瘤[10]、動脈粥樣硬化[11]以及低溫導致的肝細胞損傷[12]等。本研究中NEAT1、Gas5在對照組和各實驗組大鼠肝組織中的表達差異無統計學意義，說明二者在異煙肼所致的ADLI中作用較弱。而TUG1在ADLI大鼠中表達呈下降趨勢，表明TUG1在ADLI的發生和發展中起重要作用。為進一步探討TUG1在ADLI發生、發展中的作用機制，本研究對TUG1的上游分子SP1和下游分子HOXB7、KLF2、Caspase-3、Bcl-2 mRNA進行了檢測和分析。轉錄因子SP1是TUG1的上游分子，它可以通過TUG1啟動子區域的5個結合位點直接與TUG1結合，進而調控TUG1的轉錄[7]。本研究結果顯示，與對照組相比，實驗組SP1 mRNA與TUG1表達水平均呈下降趨勢，在下降至最低點后都略有回升，二者變化趨勢一致且SP1屬于TUG1上游分子，說明在異煙肼引發肝損傷過程中，SP1可能調控了TUG1的表達，其表達量降低進一步導致了TUG1表達下降。

許多lncRNA能夠將蛋白家族以多梳抑制復合物2(PRC2)招募到特定的基因位點[13]，使該基因啟動子區發生改變，進而抑制其表達。TUG1也是其中一員，它可以通過與PRC2結合來調控其下游分子p15、p16、p27、p57、HOXB7和KLF2基因的表達，從而影響細胞的增殖和凋亡[7,9,14,15]。

HOXB7參與調控多種信號通路，在癌細胞的增殖、分化、侵襲、遷移、黏附等活動中都扮演著重要的角色[16]。本研究中，隨ADLI時間延長，HOXB7 mRNA的相對表達量先升高后降低，而TUG1的相對表達量在給藥第10天降至最低，給藥第14天有所回升。雖然HOXB7 mRNA變化趨勢與lncRNA TUG1相反，但HOXB7 mRNA發生變化的轉折點早于TUG1，這說明HOXB7可能只是部分受TUG1的調控。

KLF2為鋅指Kruppel樣轉錄因子家族中的一員,肝癌細胞中過表達KLF2可導致G0/G1期阻滯[8]，誘導細胞凋亡[17]。此外，KLF2還可調控c-Myc基因的表達[18]，c-Myc廣泛參與細胞的增殖、凋亡、細胞周期等進程[19]。由此可見，KLF2在細胞的增殖和凋亡過程中同樣發揮著重要的作用。KLF2 mRNA的表達總體呈上升趨勢，給藥第21天升高，與TUG1總體變化趨勢相反，但其改變滯后于TUG1，提示TUG1可能通過抑制KLF2的表達調控ADLI的發生、發展。研究[15]發現，在小鼠胰島瘤細胞中干擾TUG1表達，細胞凋亡蛋白Caspase-3表達升高，而抗凋亡因子Bcl-2表達降低，細胞凋亡率升高。本研究結果顯示，各實驗組大鼠肝細胞Bcl-2表達下降，與TUG1變化一致，而Caspase-3表達逐漸升高，表明TUG1與肝細胞凋亡有關。但TUG1究竟如何影響Caspase-3和Bcl-2基因的表達還有待進一步研究。

綜上所述，ADLI大鼠肝組織TUG1低表達，其可能通過調控HOXB7、KLF2、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達參與ADLI的發生、發展，但其具體作用機制尚有待于進一步研究。

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唐山市重點實驗室基金資助項目(08150201A-1-8)。

馮福民(E-mail: fm_feng@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.009

R575

A

1002-266X(2016)39-0030-03

2016-05-25)