高脂血癥性急性胰腺炎大鼠胰腺組織NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3及Caspase-9蛋白表達觀察

吳娟，張強，鄧明明

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

?

·基礎研究·

高脂血癥性急性胰腺炎大鼠胰腺組織NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3及Caspase-9蛋白表達觀察

吳娟，張強，鄧明明

(西南醫科大學附屬醫院，四川瀘州646000)

目的 觀察高脂血癥性急性胰腺炎大鼠胰腺組織鈉鈣交換蛋白1(NCX1)、微管相關蛋白1輕鏈3 Ⅱ(LC3 Ⅱ)、自噬相關基因Beclin-1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)蛋白表達。方法 清潔級健康雄性SD大鼠40只隨機分為A、B、C、D組各10只；A組制作高脂血癥性急性胰腺炎模型，B組制作急性胰腺炎模型、C組制作高脂血癥模型，D組僅禁食、禁飲后麻醉大鼠，1 mL/kg注射生理鹽水。造模12 h時處死各組大鼠取胰腺組織，采用Western blotting法檢測各組胰腺組織NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白。結果 A、B組NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白的相對表達量均高于C、D組，P均<0.05。A組LC3 II、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白的相對表達量均高于B組，P均<0.05。C、D兩組NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9比較，P均>0.05。結論 高脂血癥性急性胰腺炎大鼠胰腺組織中NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9均高表達。NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9可能在高脂血癥性急性胰腺炎的發生發展中發揮作用。

高脂血癥；急性胰腺炎；鈣交換蛋白1；微管相關蛋白1輕鏈3 Ⅱ；自噬相關基因；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9；動物實驗

急性胰腺炎是常見的急腹癥之一，高脂血癥性急性胰腺炎是指由嚴重的高甘油三酯血癥所引起的一類胰腺炎，其發病率逐年升高[1]，但具體發病機制目前尚不明確。既往研究發現，高脂血癥性急性胰腺炎可能與CRAC、TRPV1、TRPV3鈣通道有關[2～4]。鈉鈣交換蛋白(NCX1)參與炎癥相關性疾病的鈣離子調控[5～8]。前期研究[9]證實急性胰腺炎患者胰腺組織中存在NCX1 mRNA及蛋白高表達。自噬是腺泡細胞內廣泛存在的生理現象，急性胰腺炎可導致機體出現應激性自噬或者缺陷性自噬[10]。微管相關蛋白1輕鏈3 Ⅱ(LC3 Ⅱ)、自噬相關基因Beclin-1是檢測自噬體形成的特異性標記蛋白[11]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(Caspase-9)是細胞凋亡過程中的關鍵執行分子，參與許多凋亡信號傳導途徑。目前尚未見脂質代謝異常、鈣通道、自噬在高脂血癥性急性胰腺炎發生發展中的作用機制相關報道。2015年9月～2016年5月，我們觀察了高脂血癥性急性胰腺炎大鼠胰腺組織NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 清潔級健康雄性SD大鼠40只，鼠齡2～3個月，體質量180～220 g，飼養于室溫22～25 ℃的動物房內，40%～70%恒定濕度條件下自由攝食和飲水，自然晝夜節律適應性飼養1周。四丁酚醛(Tyloxapol，烷基芳基聚醚醇型的非離子液體聚合物)及3.5%牛黃膽酸鈉購自美國Sigma公司，NCX1、Caspase-3抗體購自英國Abcam公司，LC3 Ⅱ、Beclin-1抗體購自美國CST公司,Caspase-9購自武漢三鷹公司。

1.2 大鼠分組及高脂血癥性急性胰腺炎模型制備方法 40只大鼠按照隨機數字表法分為A、B、C、D組各10只，A組制作高脂血癥性急性胰腺炎模型，采用尾靜脈注射Tyloxapol的方法[12]制作高脂血癥動物模型： 將Tyloxapol稀釋成10% Tyloxapol水溶液3 mL/kg尾靜脈注射，12 h后成模。造模成功標準：12 h后尾靜脈取血并分離血清，全自動生化分析儀檢測血清甘油三酯、膽固醇，Tyloxapol注射組大鼠血清甘油三酯以及膽固醇達對照組3倍以上視為造模成功。最終造模成功20只。采用逆行胰膽管注射牛黃膽酸鈉[13]制作急性胰腺炎模型： 12 h禁食、8 h禁飲，2%戊巴比妥鈉3 mL/kg 腹腔注射麻醉，仰臥位固定后消毒備皮，沿腹正中線做5 cm縱行切口，自幽門處沿十二指腸降段尋找到十二指腸大乳頭，用無損傷動脈夾夾閉膽總管的肝門端，用磨鈍的1 mL注射器在膽總管十二指腸開口位置的對側腸壁找一無血管區穿刺進入胰膽管，3.5%牛黃膽酸鈉溶液1 mL/kg緩慢注入胰膽管，速度0.1 mL/min,待胰腺組織出現水腫出血后，松開動脈夾，拔出注射器，將腸管還納至腹腔后，關閉腹腔。造模成功標準：造模后12 h，麻醉大鼠，下腔靜脈取血并分離血清，全自動生化分析儀檢測血清淀粉酶、脂肪酶，以正常大鼠血中淀粉酶作為對照組；完整切取胰腺組織，固定于中性甲醛溶液中，用于制作病理學切片，觀察切片胰腺組織的炎癥壞死情況，進行病理學評分，以正常大鼠的胰腺組織作為對照組；若造模組切片的病理學評分以及血清淀粉酶、脂肪酶與正常組相比有顯著差異性則視為造模成功。最終造模成功15只。B組制作急性胰腺炎模型方法同上、C組制作高脂血癥動物模型方法同上，D組為空白對照，僅禁食、禁飲后麻醉大鼠，1 mL/kg注射生理鹽水。

1.3 各組胰腺組織NCX1、LC3Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白檢測方法 采用Western blotting法。造模12 h時處死各組大鼠，取胰腺組織，蛋白裂解液量提取組織中蛋白，95 ℃水浴5 min，采用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品總蛋白濃度,取6 μL/孔總蛋白，SDS-PAGE電泳90 min，常規轉膜，5%脫脂牛奶室溫封閉3 h,TBST洗膜，加入稀釋的NCX1、LC3Ⅱ，Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入稀釋的NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9二抗(1:10 000)室溫孵育30 min, ECL曝光顯影。以GAPDH作為內參，用Image J軟件進行灰度掃描進行定量分析。以目的蛋白與GAPDH灰度值之比表示目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計軟件。計量資料采用表示，組間比較首先行Levene檢驗，若方差齊則采用完全隨機方差分析，若結果有統計學意義，則進一步采用LSD法進行兩兩比；如方差不齊，則采用非參數檢驗的秩和檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組胰腺組織NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量比較見表1。

表1 各組胰腺組織NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9蛋白相對表達量比較

3 討論

存在脂質代謝障礙的患者中有15%～20%可能發生高脂血癥急性胰腺炎[1]，在這些患者血中存在大量的不飽和脂肪酸、乳糜微粒等物質，血液呈現高凝狀態，胰腺微循環障礙，加重胰腺局部缺血壞死；國外研究報道引起急性胰腺炎向重癥急性胰腺炎(SAP)轉化的是胰腺周圍脂肪壞死脂解作用及其產生的不飽和脂肪酸;使用針對胰周脂肪壞死和抑制不飽和脂肪酸生成的藥物可用于改善SAP預后，尤其是在高脂血癥基礎上發生的急性胰腺炎[14]。高脂血癥對于胰腺的損傷是多角度、多途徑的，所以高脂血癥急性胰腺炎臨床癥狀重，且易向重癥轉化，本研究旨在探討參與高脂血癥急性胰腺炎這種特性的可能途徑。

生理狀態下NCX1是鈣外排的主要途徑，例如在生理性的胰島素分泌、心肌及神經元傳導時NCX1的作用是泵出胞漿內多余鈣離子以維持生理功能的平衡[4]，但在大多數疾病過程中NCX1的功能卻發生了逆轉。NCX1作為重要的雙向鈣通道，參與了消化系統許多疾病的發生發展過程，如實驗性結腸炎的發生與NCX1通道的基因表達被抑制有關[5]、NCX1基因敲除的小鼠呈現出胃底的高度松弛并且胃排空加快[6]、NCX1與鈣調蛋白以及NHX1形成的復合體共同參與調節IL-6相關的肝細胞癌的細胞學行為[7]。前期曾有文獻報道急性胰腺炎中確實存在NCX1通道的開放，而通過本實驗的研究結果可以看出，高脂血癥急性胰腺炎NCX1通道蛋白的表達也是明顯上調，但是與普通胰腺炎組相比并沒有明顯差異，由此可見，NCX1確實參與了高脂血癥胰腺炎，但可能不是惟一參與調節的鈣通道，參與高脂血癥急性胰腺炎調控的可能存在多種通道，NCX1通道在這些鈣通道中是否起著關鍵作用，還需進一步研究證實。

自噬是細胞內重要的降解途徑，自噬以腺泡細胞基質內自溶酶體和自噬體的形成為主要特征， LC3是將細胞內LC3 Ⅰ轉化成LC3Ⅱ,并且整合到自噬體膜上，當自噬體融合成溶酶體時LC3Ⅱ將會被降解，當發生急性胰腺炎時可以檢測到LC3Ⅱ的濃度顯著增高[16]，因為此時自噬體的融合障礙，LC3Ⅱ降解減少。Beclin-1蛋白也是重要的自噬分子標志，參與自噬前體的形成。在本研究結果當中，可以觀察到，A組LC3Ⅱ、Beclin-1 蛋白的表達量與B組的表達量具有顯著差異，表明在高脂血癥急性胰腺炎中自噬功能受損程度較普通胰腺炎有增加的趨勢。由此我們可以做出這樣假設，高脂血癥可以通過某種特殊途徑或者某種物質影響自噬體的融合，影響胰腺局部以及全身代謝廢物的清除，從而加速胰腺局部炎癥壞死，加重胰腺炎癥狀。

急性胰腺炎中存在廣泛的細胞凋亡、壞死[19]，自噬可以通過影響細胞內鈣穩態以及酶原激活而引起腺泡細胞凋亡壞死，本研究發現，與空白對照組相比，急性胰腺炎中確實檢測到鈣通道蛋白、自噬相關蛋白、凋亡蛋白表達量、胰腺組織病理學評分、以及血清酶學的增高。更重要的是，在我們的實驗結果中還觀察到，高脂血癥急性胰腺炎中上述各種指標(除鈣通道蛋白外)與普通急性胰腺炎相比，均表現為明顯的增高趨勢。由此可見，在高脂血癥這個特殊背景下，自噬以及鈣超載相關通道得到了促進，致使高脂血癥急性胰腺炎的凋亡壞死較非高脂狀態下的急性胰腺炎更嚴重。

綜上所述，高脂血癥性急性胰腺炎組織中存在NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9高表達。NCX1、LC3 Ⅱ、Beclin-1、Caspase-3、Caspase-9可能在高脂血癥性急性胰腺炎的發生發展中發揮作用。

[1] Valdivielso P, Ramírez-Bueno A, Ewald N. Current knowledge of hypertriglyceridemic pancreatitis[J]. Eur J Intern Med, 2014,25(8):689-694.

[2] Gerasimenko JV, Gryshchenko O, Ferdek PE, et al. Ca2+release-activated Ca2+channel blockade as a potential tool in antipancreatitis therapy[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013,110(32):13186-13191.

[3] Vigna SR , Shahid RA, Liddle RA.Ethanol contributes to neurogenic pancreatitis by activation of TRPV1[J]. FASEB J, 2014,28(2):891-896.

[4] Kim MS, Hong JH, Li Q, et al. Deletion of TRPC3 in micstore-operated Ca2+influx and the severity of acute pancreatitis[J].Gastroenterology, 2009,137(4):1509-1517.

[5] Radhakrishnan VM, Kojs P, Ramalingam R ，et al. Experimental colitis is associated with transcriptional inhibition of Na+/Ca2+exchanger isoform 1 (NCX1) expression by interferon gamma in the renal distal convoluted tubules[J]. J Biol Chem, 2015,290(14):8964-8974.

[6] Azuma YT, Hayashi S, Nishiyama K，et al. Na /Ca exchanger-heterozygote knockout mice display increased relaxation in gastric fundus and accelerated gastric transit in vivo[J]. Neurogastroenterol Motil, 2016,28(6):827-836.

[7] Xu J, Ji B, Wen G, et al. Na+/H+exchanger, Na+/Ca2+exchanger 1 and calmodulin complex regulates interleukin 6-mediated cellular behavior of human hepatocellular carcinoma[J]. Carcinogenesis, 2016 ,37(3):290-300.

[8] Sathish V, Delmotte PF, Thompson MA, et al. Sodium-calcium exchange in intracellular calcium handling of human airway smooth muscle[J]. PLoS One, 2011,6(8):e23662.

[9] 余森源,謝睿,陳昱楊,等. 鈉鈣交換體NCX1在急性胰腺炎發生、發展中的作用[J]. 第三軍醫大學學報,2015,37(13):1325-1330.

[10] Xu B, Bai B, Sha S, et al. Interleukin-1beta induces autophagy by affecting calcium homeostasis and trypsinogen activation in pancreatic acinar cells[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(7):3620-3631.

[11] Sun L, Zhang S, Yu C，et al. Hydrogen sulfide reduces serum triglyceride by activating liver autophagy via the AMPK-mTOR pathway[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2015,309(11):925-935.

[12] Harisa GI, Alomrani AH , Badran MM，et al.Simvastatin-loaded nanostructured lipid carriers attenuate the atherogenic risk of erythrocytes in hyperlipidemic rats[J]. Eur J Pharm Sci, 2016,96(7):62-71.

[13] Huang W, Cane MC, Mukherjee R,et al.Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+release[J]. Gut, 2015,64(30):36-39.

[14] Noel P, Patel K, Durgampudi C, et al. Peripancreatic fat necrosis worsens acute pancreatitis independent of pancreatic necrosis via unsaturated fatty acids increased in human pancreatic necrosis collections[J]. Gut, 2016,65(1):100-11.

[15] Gukovskaya AS, Gukovsky I.Autophagy and pancreatitis[J]. Am J Phy Gastrointest Liver Phy, 2012,303(9):993-1003.

[16] Zhu H, Yu X , Zhu S, et al. The fusion of autophagosome with lysosome is impaired in L-arginine-induced acute pancreatitis[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015，8(9):11164-11170.

瀘州市-西南醫科大學聯合項目[2015LZCYD-S04(6/15)]。

鄧明明(E-mail： 793070544@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.008

R657.5

A

1002-266X(2016)39-0027-03

2016-05-05)