耐藥人胃癌細胞UHRF1基因的表達變化及其與多藥耐藥的關(guān)系

周林，李偉，韓東升，張偉

(中國人民解放軍第八十八醫(yī)院，山東泰安271000)

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·論著·

耐藥人胃癌細胞UHRF1基因的表達變化及其與多藥耐藥的關(guān)系

周林，李偉，韓東升，張偉

(中國人民解放軍第八十八醫(yī)院，山東泰安271000)

目的 觀察耐藥人胃癌細胞泛素樣含PHD和環(huán)指域1(UHRF1)基因的表達變化，并探討其與胃癌細胞多藥耐藥的關(guān)系。方法 取對數(shù)生長期人胃癌細胞SGC7901、耐長春新堿(VCR)的SGC7901(SGC7901/VCR)、耐阿霉素(ADR)的SGC7901(SGC7901/ADR)，采用實時定量PCR法檢測各細胞UHRF1 mRNA，采用Western blotting法檢測各細胞UHRF1蛋白。 取對數(shù)生長期SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞分別轉(zhuǎn)染抑制UHRF1表達的小干擾RNA(siUHRF1)(SGC7901/VCR-siUHRF1、SGC7901/ADR-siUHRF1)、無意義空白質(zhì)粒(SGC7901/VCR-UHRF1、SGC7901/ADR-UHRF1)，另設(shè)空白對照，不做任何處理。取對數(shù)生長期SGC7901細胞，分別轉(zhuǎn)染過表達的UHRF1質(zhì)粒(SGC7901-UHRF1)、無意義空白質(zhì)粒(SGC7901-NC)，另設(shè)空白對照。轉(zhuǎn)染48 h收集以上細胞備用。采用MTT法檢測SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞各干擾組和SGC7901細胞各干擾組對化療藥物[(VCR、ADR、5-氟尿嘧啶(5-FU)和順氨氯鉑(CDDP)]的藥物敏感性，計算半數(shù)抑制濃度(IC50)；取SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞各干擾組和SGC7901空白對照，加入5-FU共培養(yǎng)，采用流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。結(jié)果 SGC7901細胞UHRF1 mRNA及蛋白的相對表達量均低于SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞，P均<0.05。促進UHRF1表達可升高SGC7901細胞對VCR、ADR、5-FU、CDDP 的IC50，降低細胞凋亡率,P均<0.05。抑制UHRF1表達可降低VCR、ADR、5-FU、CDDP對SGC7901/VCR和SGC7901/ADR細胞的IC50，升高細胞凋亡率，P均<0.05。結(jié)論 耐藥人胃癌細胞中存在UHRF1高表達。UHRF1高表達可降低胃癌細胞的藥物敏感性、提高細胞多藥耐藥性，可能與UHRF1抑制胃癌細胞凋亡有關(guān)。

胃癌；泛素樣含PHD和環(huán)指域1；多藥耐藥；藥物敏感性；半數(shù)抑制濃度；細胞凋亡

化療是進展期胃癌的主要治療方式之一，但部分胃癌患者對化療藥物不敏感，研究認為胃癌細胞的多藥耐藥是其主要原因[1, 2]。胃癌細胞多藥耐藥的具體發(fā)生機制目前尚不明確[3, 4]。泛素樣含PHD和環(huán)指域1(UHRF1)是表觀遺傳學的調(diào)控因子，是一種重要的促癌分子[5]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1促進胃癌細胞的增殖和侵襲，并且UHRF1高表達提示預后較差[6～9]，但其在胃癌細胞多藥耐藥中的作用機制尚不清楚。本研究觀察了耐藥人胃癌細胞UHRF1基因的表達變化，并探討其與胃癌細胞多藥耐藥的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、材料及試劑 人胃癌細胞系SGC7901和人耐長春新堿(VCR)SGC7901(SGC7901/VCR)、人耐阿霉素(ADR)SGC7901(SGC7901/ADR)均來自第四軍醫(yī)大學腫瘤生物學國家重點實驗室，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中SGC7901/VCR和SGC7901/ADR分別加入終濃度1 μg /mL的長春新堿和0.5 μg /mL的阿霉素維持耐藥性。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司； RNA裂解液TRIzol購自美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒、UHRF1和GAPDH引物購自大連TaKaRa公司；總蛋白提取試劑盒購自上海碧云天公司，UHRF1和β-actin抗體購自北京中杉金橋公司；過表達的UHRF1質(zhì)粒、抑制UHRF1表達的小干擾RNA(siUHRF1)及無意義空白質(zhì)粒由上海吉凱基因公司合成；Annexin V/碘化丙啶(PI)檢測試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司。

1.2 SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901SG/ADR細胞UHRF1 mRNA及蛋白檢測 取對數(shù)生長期SGC7901/VCR、SGC7901/ADR、SGC7901細胞，采用實時定量PCR法檢測各細胞UHRF1 mRNA，應用TRIzol 法提取總RNA，取5 μg RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以GAPDH基因作為內(nèi)參。UHRF1上游引物5′-GTCGAATCATCTTCGTGGAC-3′，下游引物5′-AGTACCACCTCGCTGGCAT-3′；GAPDH上游引物5′-GGTGAAGGTCGGA-GTCAAC-3′ ，下游引物5′-AGAGTTAAAAGC-AGCCCTGGTG-3′。PCR 擴增條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；反應體系50 μL。用2-ΔΔCT表示目的基因的相對表達量。采用Western blotting法檢測各細胞UHRF1蛋白，按照蛋白提取試劑盒說明裂解細胞后提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳50 min，半干法轉(zhuǎn)膜17 min，5%脫脂奶粉室溫封閉20 min，加入一抗( 鼠抗人UHRF1單克隆抗體，1∶400) ，4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌， 加入HRP 標記的二抗(羊抗鼠UHRF1單克隆抗體，1∶2 000) ，室溫孵育1 ～1.5 h，TBST 洗滌，ECL 顯色，曝光，凝膠成像儀拍照(Biorad)，Quantity One 軟件進行定量分析。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與β-actin灰度值之比作為UHRF1蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

1.3 UHRF1對胃癌細胞藥物敏感性及細胞凋亡的影響觀察

1.3.1 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞分別用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染siUHRF1(SGC7901/VCR-siUHRF1、SGC7901/ADR-siUHRF1)、無意義空白質(zhì)粒(SGC7901/VCR-UHRF1、SGC7901/ADR-UHRF1)，另設(shè)空白對照，不做任何處理。取對數(shù)生長期SGC7901細胞，分別轉(zhuǎn)染SGC7901-UHRF1、無意義空白質(zhì)粒(SGC7901-NC)，另設(shè)空白對照。轉(zhuǎn)染48 h收集以上細胞備用。

1.3.2 SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901SG/ADR細胞對化療藥物[VCR、ADR、5-氟尿嘧啶(5-FU)和順氨氯鉑(CDDP)]的敏感性觀察 采用MTT法。取“1.3.1”中細胞，5×103/孔接種于96孔板，每組30個復孔，待細胞貼壁后吸棄培養(yǎng)液，分別加入0．005、0．05、0．5、5、50 mg /L的各種化療藥物(VCR、ADR、5-FU和CDDP)200 μL，將僅加細胞但不加藥物干預作為陰性對照組，以不加細胞而僅加培養(yǎng)液作為空白組，各濃度5個復孔。常規(guī)培養(yǎng)48 h 后，每孔加入50 μL MTT 溶液，培養(yǎng)4 h ，吸棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩15 min，充分溶解結(jié)晶物。采用酶聯(lián)免疫檢測儀上測定490 nm 波長下各孔吸光度(A)值，重復測定3 次，計算各種化療藥物對各組細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50) ，IC50反映細胞的藥物敏感性。

1.3.3 SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術(shù)。取對數(shù)生長期“1.3.1”中細胞，接種于6孔板內(nèi)。培養(yǎng)24 h加入終濃度為40 g/L的5-FU，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。收集各組細胞，PBS 洗滌3次，按試劑盒說明書采用Annexin V-FITC/ PI 進行雙標記，避光放置10 min，流式細胞儀觀察各組細胞凋亡情況。計算細胞凋亡率。實驗重復3 次。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用表示，結(jié)果比較采用t檢驗，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞UHRF1mRNA及蛋白表達比較SGC7901/VCR、SGC7901/ADR、SGC7901細胞UHRF1mRNA的相對表達量分別為4.03±0.90、3.77±0.78、1.00±0.00，SGC7901細胞UHRF1mRNA的相對表達量明顯低于SGC7901/VCR(t=4.75,P<0.05)、SGC7901/ADR(t=5.04，P<0.05)，SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞UHRF1mRNA的相對表達量間比較差異無統(tǒng)計學意義(t=2.22,P>0.05)。SGC7901/VCR、SGC7901/ADR、SGC7901細胞UHRF1蛋白的相對表達量分別為3.05±0.52、2.84±0.63、1.00±0.00，SGC7901細胞UHRF1蛋白的相對表達量明顯低于SGC7901/VCR(t=6.83,P<0.01)、SGC7901/ADR(t=5.06,P<0.01)，SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞UHRF1蛋白相對表達量間比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.45,P>0.05)。

2.2VCR、ADR、5-FU、CDDP對SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞的IC50比較VCR、ADR、5-FU、CDDP對SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞的IC50見表1。

表1 VCR、ADR、5-FU、CDDP對SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞的IC50比較

2.3 SGC7901、SGC7901/VCR、SGC7901/ADR細胞凋亡率比較 SGC7901、SGC7901-NC和SGC7901-UHRF1的細胞凋亡率分別為28.70%±3.03%、27.40%±2.81%和12.70%±1.43%，SGC7901-UHRF1細胞凋亡率明顯高于其余兩者(t分別為14.09、14.93，P均<0.05)；SGC7901/VCR、SGC7901/VCR-NC和SGC7901/VCR-UHRF1的細胞凋亡率分別為8.90%±0.33%、8.77%±0.45%和37.63%±2.33%，SGC7901/VCR-siUHRF1細胞凋亡率明顯高于其余兩者(t分別為20.24、21.27，P均<0.05)；SGC7901/ADR、SGC7901/ADR-NC和SGC7901/ADR-UHRF1細胞凋亡率分別為8.90%±0.33%、8.77%±0.45%和37.63%±2.33%，SGC7901/ADR-siUHRF1細胞凋亡率明顯高于其余兩者(t分別為16.95、15.43，P均<0.05)。

3 討論

胃癌是最常見的消化道腫瘤,患者5年生存率極低[2]。胃癌細胞出現(xiàn)多藥耐藥性是胃癌患者5年生存率較低的主要原因[1,5],其發(fā)生機制包括藥物排出增加、細胞內(nèi)藥物集聚再分配、藥物解毒功能的增強、藥物靶分子的改變、DNA損傷修復的增強及藥物引起細胞凋亡受抑等[3,4,10]。UHRF1是UHRF超家族成員之一，作為轉(zhuǎn)錄因子可與拓撲異構(gòu)酶Ⅱα基因的啟動子結(jié)合，從而調(diào)控其表達水平[11]。研究表明UHRF1可通過表觀遺傳學機制，如DNA甲基化、組蛋白脫乙酰化、組蛋白甲基化和組蛋白泛素化等，來調(diào)控基因的表達[11,12]。UHRF1參與眾多生理和病理活動，其中包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展。UHRF1在多種腫瘤中表達增加，并且異常表達的UHRF1可導致BRCA1、CDKN2A、p73和RASSF1等抑癌基因的超甲基化[5,13～16]。近期研究表明，UHRF1在腫瘤的增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等進程發(fā)揮重要作用[13～16]。Jin等[17]的研究發(fā)現(xiàn)UHRF1可與多藥耐藥基因1(MDR1)的啟動子結(jié)合，從而調(diào)控乳腺癌的耐藥[17]。Fang等[18]進一步證明下調(diào)UHRF1表達可有效提高乳腺癌細胞對順鉑的敏感性。本課題組之前的研究證實，UHRF1在胃癌組織和細胞中均高表達，其表達水平可作為胃癌預后的重要指標，并且UHRF1參與胃癌的增殖與轉(zhuǎn)移。然而，UHRF1在胃癌多藥耐藥中的作用尚未有研究報道。

本研究首先發(fā)現(xiàn)UHRF1在胃癌耐藥細胞系SGC7901/VCR和SGC7901/ADR中的表達遠遠高于其相應親本細胞系SGC7901，初步提示了UHRF1在胃癌耐藥中發(fā)揮重要作用，是一種潛在的、耐藥相關(guān)的癌基因。進一步改變細胞中UHRF1的表達水平發(fā)現(xiàn)，UHRF1表達下調(diào)，耐藥細胞系對多種化療藥物的敏感性顯著增加，并且細胞凋亡增加，而UHRF1表達上調(diào)，胃癌細胞系對眾多化療藥物的敏感性明顯減弱，細胞凋亡減少。本研究結(jié)果表明UHRF1基因促進胃癌多藥耐藥的發(fā)生，其可能機制是抑制胃癌細胞的凋亡，然而進一步具體分子機制仍不清。結(jié)合以往UHRF1在其他腫瘤中的研究，我們猜測有以下幾種可能作用機制：①與MDR1基因的啟動子結(jié)合調(diào)控胃癌的耐藥；②調(diào)控胃癌凋亡相關(guān)基因。

綜上所述，耐藥人胃癌細胞中存在UHRF1高表達。UHRF1高表達可降低胃癌細胞的藥物敏感性、提高多藥耐藥性，其機制可能與UHRF1抑制胃癌細胞凋亡有關(guān)。

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Expression of UHRF1 gene in gastric cancer resistant cells and its relationship with multidrug resistance

ZHOULin,LIWei,HANDongsheng,ZHANGWei

(The88thHospitalofPLA,Taian271000,China)

Objective To observe the expression changes of ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1 (UHRF1) in gastric cancer drug-resistance cells, and to explore the relationship with gastric cancer multidrug resistance. Methods We examined UHRF1 mRNA and protein expression in GC multidrug-resistant cell lines SGC7901/VCR and SGC7901/ADR and their parental cell line SGC7901 by RT-PCR and Western blotting. Small interfering RNA (siUHRF1) was transfected into SGC7901/VCR and SGC7901/ADR cells (SGC7901/VCR-siUHRF1, SGC7901/ADR-siUHRF1), respectively; and blank control group without any treatment was set. UHRF1 plasmid with overexpression (SGC7901-UHRF1) and empty blank plasmid (SGC7901-NC) were transfected into SGC7901 cells, and blank control group was also established. After 48-hour transfection, the cells were collected for further use. MTT assay was conducted to detect the GC cell line sensitivity to several chemotherapy drugs, including VCR, ADR, 5-FU and CDDP, and IC50was calculated. 5-FU was co-cultured with gastric cancer cell lines and the apoptosis was observed by flow cytometry (FCM). Results The relative mRNA and protein expression of UHRF1 in SGC7901 cell line was down-regulated as compared with that of SGC7901/VCR and SGC7901/ADR cells (allP<0.05). Promoting the expression of UHRF1 could increase the IC50of SGC7901 cells to VCR, ADR, 5-FU and CDDP and the apoptosis was decreased (allP<0.05). Silencing UHRF1 expression could reduce the IC50of SGC7901/VCR and SGC7901/ADR cells to VCR, ADR, 5-FU and CDDP, and the apoptosis rate was increased (allP<0.05).Conclusions UHRF1 is highly expressed in gastric cancer drug-resistance cell lines, and the high expression of UHRF1 may decrease drug sensitivity and improve multidrug resistance of gastric cancer, which may be related to the inhibition of UHRF1 on the apoptosis of gastric cancer cells.

gastric carcinoma; ubiquitin-like with PHD and ring finger domain 1; multidrug resistance; drug sensitivity; median inhibitory concentration; apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81402337)。

周林(1988-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向為胃腸道腫瘤的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: zhoulin1105@163.com

簡介：張偉(1967-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要研究方向為消化系統(tǒng)疾病的基礎(chǔ)與臨床。E-mail: chunll88@sohu.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.001

R735.2

A

1002-266X(2016)39-0001-04

2016-07-22)