快速線掃描拉曼成像技術在研究CaSki細胞凋亡過程中的應用

張金亮, 馬 鑫, 徐夢溪, 宗 鋮, 任 斌

(廈門大學化學化工學院, 固體表面物理化學國家重點實驗室, 廈門 361005)

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快速線掃描拉曼成像技術在研究CaSki細胞凋亡過程中的應用

張金亮, 馬 鑫, 徐夢溪, 宗 鋮, 任 斌

(廈門大學化學化工學院, 固體表面物理化學國家重點實驗室, 廈門 361005)

應用快速線掃描拉曼成像技術研究了在抗腫瘤藥物順鉑誘導下宮頸癌CaSki細胞凋亡過程中細胞色素c、 蛋白質和脂質等的時空變化規律. 結果表明, 細胞色素c與蛋白質的相對拉曼峰強可以反映細胞凋亡程度. 與常用的表征細胞活性的噻唑藍(MTT)實驗的統計方法相比, 利用拉曼成像技術可以更靈敏地觀察到細胞凋亡早期生物活性分子的變化, 從而在單細胞水平檢測細胞凋亡過程, 為解析藥物與細胞的作用機制提供分子水平信息.

宮頸癌; 細胞色素c; 凋亡; 拉曼光譜; 拉曼成像; 噻唑藍法

癌細胞的凋亡是大量胞內分子同時參與的復雜過程. 從單細胞水平上研究癌細胞在藥物作用下的凋亡過程將有助于認識藥物與癌細胞作用機理, 對高效治療癌癥具有重要的科學意義. 但目前從單個活細胞和單分子水平上探究生命問題對于傳統生物醫學手段仍是一個巨大的挑戰, 對癌細胞凋亡過程的分子動態時空演變信息仍然了解甚少.

近年來, 流式細胞術、 掃描探針顯微技術和熒光顯微術等單細胞技術發展較快, 其中流式細胞術可以實現單個細胞快速高通量的生物學分析, 獲得細胞的物理化學特性, 但缺乏空間分辨的信息[1～3]. 掃描探針顯微技術不僅可以研究單個細胞膜表面微結構的形貌信息, 還可以對胞內相關細胞器進行分子水平上的操作, 但是會對細胞產生應力, 影響細胞的正常生理功能[4]. 熒光顯微技術為在單細胞水平上研究細胞生物學過程提供了豐富的信息, 也是目前單細胞研究的主要方法, 但熒光技術需要借助外來標記分子, 會對細胞的微環境以及被標記分子的功能產生一定的干擾, 難以如實反映生物分子的本征信息, 特別是對一些重要的生物活性分子, 如小分子和脂類等尚難以進行熒光標記而不影響其生物學活性; 此外, 熒光峰通常較寬, 難以同時實現多組分檢測[5～7]. 拉曼光譜技術不會發生生物分子光漂白, 適合長時間對活體樣品進行檢測; 無需標記即可獲得體系的指紋特征, 排除了標記分子對生物體系的干擾甚至破壞; 其光譜特征由分子自身振動特征決定, 不易受外界干擾; 譜峰窄, 可以進行多組分同時檢測. 因此, 拉曼光譜能夠同時獲得整個細胞的光譜信息, 對研究細胞內多種分子同時參與的凋亡過程具有顯著優勢.

宮頸癌是全球女性的第二大癌癥殺手, 根據其攜帶的人類乳頭瘤病毒的型號, 宮頸癌細胞可分為HeLa, SiHa, C33A和CaSki等幾種[8～11]. 順鉑是常見的抗腫瘤藥物, 具有很好的抗腫瘤功效[12～15]. 目前認為順鉑與癌細胞的作用機理主要有2種: 一種認為順鉑與細胞核內DNA的堿基形成絡合物, 阻止DNA的解旋、 復制等過程, 從而抑制癌細胞的增長[16～18]; 另一種認為順鉑可以誘導細胞內產生活性氧, 從而誘導細胞凋亡[19～22].

本文選擇宮頸癌CaSki細胞作為研究的細胞系, 運用快速線掃描拉曼成像技術對順鉑作用后的CaSki細胞的凋亡過程進行實時監測. 通過拉曼成像分析對活細胞內生物分子如細胞色素c、 蛋白質、 脂質等的含量和分布進行了分析, 從而獲得細胞凋亡過程的分子信息, 為順鉑抗腫瘤機理的研究提供分子水平信息.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

DMEM高糖培養基(美國Gbcio公司); 鏈霉素、 青霉素、 噻唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)(廈門鷺隆生物科技有限公司); 胎牛血清(美國Hyclone公司); 胰蛋白酶(Trypsin, 美國Amersco公司)、 磷酸鹽緩沖溶(PBS, pH=7.2～7.4, 每升含NaCl 8.0 g, KCl 0.2 g, Na3HPO41.15 g, KH3PO40.2 g); 順鉑(上海阿拉丁試劑有限公司). 順鉑藥物采用DMEM培養基配制, 現配現用.

AE20型倒置顯微鏡(廈門MOTIC公司); DK-S22型電熱恒溫水槽(上海精宏設備有限公司); Sterilgard Ⅲ型生物安全柜(美國Baker公司), SCO6AD型氣套式CO2培養箱(美國Shellab公司); Raman-11快速共聚焦拉曼成像光譜儀(日本Nanophoton公司); EnSpire酶標儀(美國PerkinElmer公司).

1.2 細胞培養與細胞活性MTT實驗

實驗細胞系為宮頸癌CaSki細胞. 細胞培養基為含1%(體積分數)鏈霉素, 1%(體積分數)青霉素和10%(體積分數)胎牛血清的DMEM高糖培養基. 培養環境為含5%(體積分數)CO2和95%(體積分數)空氣的混合氣環境, 培養溫度為37 ℃.

通過細胞計數板將CaSki細胞的密度控制在105Cell/mL左右, 然后將細胞懸浮液種在96孔板中, 每孔種100 μL, 并設置調零孔和空白組. 種片24 h后, 分別加入0, 2, 4, 8, 10 mmol/L的順鉑溶液, 并作用24 h, 獲得順鉑對CaSki細胞的半抑制濃度(IC50).

將IC50濃度的順鉑溶液加入到96孔板中, 每孔加150 μL, 分別和細胞作用4, 8, 12, 16, 24, 48 h后加入5 mg/mL的MTT溶液各10 μL, 孵育4 h. 小心吸去上層溶液, 每孔加入150 μL DMSO溶液, 作用0.5 h后搖勻, 用酶標儀測量孔板的吸光度, 激光波長為490 nm.

1.3 細胞拉曼成像實驗

將Caski細胞種片24 h后, 加入IC50濃度的順鉑溶液分別作用4, 8, 12, 16, 24, 48 h, 然后將細胞放到經除菌處理過的蓋玻片上, 滴加PBS對細胞封片處理, 然后進行拉曼成像. 該處理方法可以避免細胞暴露在外界環境下發生不可控變化, 保持細胞的正常生命活動, 從而在成像時間內可以固定細胞的形貌, 避免發生顯著變化, 使檢測到的細胞信號變化可以如實反映順鉑與細胞的作用.

將532 nm激光束通過柱面鏡轉換為橢形光斑, 并經過動鏡掃描形成均勻的線光源, 再通過100倍油鏡[數值孔徑(NA)=1.4, Nikon公司, Type A型浸潤油]照射在細胞上, 對應成像寬度為80 μm. 結合動鏡掃描, 獲得80 μm×20 μm細胞拉曼成像圖, 拉曼圖像中每個像素大小約為200 nm×200 nm. 每條線的曝光時間為10 s, 線激光功率為6 mW/像素. 選擇600 道光柵進行分光, 對應采譜范圍為580～3025 cm-1.

2 結果與討論

2.1 細胞活性MTT實驗分析

首先采用生物醫學中常用的MTT法來測算順鉑對CaSki細胞作用的IC50. 與不同濃度順鉑作用24 h后細胞的存活率如圖1所示. 可見, 細胞凋亡比例與順鉑藥物濃度呈良好的正相關性. 當順鉑濃度為4 mmol/L時, 細胞24 h的存活率降到50%左右, 該濃度即為順鉑作用于CaSki細胞的IC50值. 選擇4 mmol/L這一藥物濃度研究了順鉑對細胞作用不同時間后細胞的凋亡情況, 結果如圖2所示. 可見, 4 mmol/L的順鉑與CaSki細胞作用4 h和8 h后, 細胞存活率和無藥物的對照組基本一致, 說明該時間范圍內順鉑并沒有導致細胞發生明顯的凋亡. 而當藥物作用12 h后, 細胞存活率降低到70%. 作用時間延長到48 h后, 細胞的存活率低于20%. 采用MTT法檢測細胞毒性時, 需要作用較長時間才能反映出細胞的凋亡信息, 而且無法獲得細胞凋亡過程中細胞內分子動態變化信息.

Fig.1 Viability of CaSki cells after being treated with different concentrations of cisplatin for 24 h

Fig.2 Time-depended viability of CaSki cells after being treated with 4 mmol/L cisplatin

2.2 拉曼成像分析

Fig.3 Time depended bright field images(A1—F1) and Raman images using raman peaks of cytochrome c(750 cm-1)(A2—F2), protein(1660 cm-1)(A3—F3), and lipid(2852 cm-1)(A4—F4) of cells after being treated with 4 mmol/L cisplatin for 0 h(A1—A4), 4 h(B1—B4), 8 h(C1—C4), 12 h(D1—D4), 24 h(E1—E4) and 48 h(F1—F4)

2.2.1 細胞內生物分子成像分析 根據上述MTT實驗, 選擇用4 mmol/L順鉑溶液來誘導CaSki細胞的凋亡. 待藥物和細胞作用不同時間后, 對細胞進行顯微觀察和拉曼成像, 結果如圖3所示. 可見, 當順鉑與細胞作用時間短于12 h時, 從細胞白光顯微圖像上觀察不到細胞形貌的明顯變化; 當作用時間延長到24 h后, 細胞發生皺縮, 細胞膜結構消失, 表明細胞已經發生明顯凋亡, 如圖3(A1～F1)所示. 在顯微觀察時用拉曼光譜對細胞進行成像, 圖3(A2～F2), (A3～F3), (A4～F4)分別是用代表細胞色素c(750 cm-1)、 蛋白質酰胺Ⅰ帶(1660 cm-1)和細胞內飽和脂質(2852 cm-1)[16,18,23,24]的特征拉曼峰強度作的拉曼顯微圖像. 可見, 在沒有順鉑作用下, 細胞內的細胞色素c含量較多, 呈顆粒狀分布, 表明細胞色素c分布在線粒體內, 而且細胞內含有少量脂滴. 當用順鉑作用4 h和8 h后, 細胞色素c的含量減少, 并呈云霧狀彌散分布, 表明細胞色素c開始從線粒體內釋放到細胞質中. 作用時間繼續延長, 細胞色素c繼續減少, 48 h后完全消失. 脂質的含量隨著藥物作用時間的延長而增加, 脂滴逐漸增多. 拉曼光譜中1660 cm-1處的信號峰可歸屬于蛋白質和脂質. 由于蛋白質分布在整個細胞中, 而飽和脂類主要出現在脂滴部分, 因此觀察到1660和2852 cm-1處的峰在脂滴部分重合, 而在細胞其它部位沒有明顯重合的現象. 此外, 隨著順鉑作用時間的延長, 細胞內非脂滴區域蛋白質的成像結果沒有發生明顯變化, 說明細胞內蛋白質的含量和分布基本穩定. 因此在后面數據處理中皆以細胞內非脂滴區域1660 cm-1處的峰強度作為內標. 拉曼成像結果表明, 細胞在凋亡過程中, 細胞色素c會從線粒體中釋放到細胞質中, 被細胞內活性氧氧化而信號強度減弱, 并逐漸消失. 細胞中的脂質會在細胞凋亡過程中顯著增多, 這可能是由細胞凋亡過程中細胞中的脂質受到活性氧作用發生團聚所致[19].

Fig.4 Intensity of 750 and 1660 cm-1 peaks and ratio of I750/I1660 of the cells after being treated with 4 mmol/L cisplatin for different time

2.2.2 細胞色素c與蛋白質拉曼信號相對強度分析 在藥物與細胞作用不同時間的拉曼成像數據中, 蛋白質酰胺Ⅰ帶(1660 cm-1)的強度隨時間變化不大(圖4), 表明細胞內的蛋白質總量與個體差異不明顯, 而且在細胞凋亡過程中也不會發生明顯變化; 而歸屬于細胞色素c的750 cm-1處的峰則變化顯著. 因此選擇1660 cm-1處的峰作為內標, 研究細胞與藥物作用后細胞色素c的含量變化. 實驗中, 每個作用時間隨機選擇3個細胞作為平行樣品. 每個細胞隨機選取細胞質中5個12×12像素的拉曼信號進行分析. 數據選擇過程中注意避開脂滴聚集區域. 由圖4可見, 在沒有藥物作用條件下, 細胞中I750/I1660的比值較高, 說明此時細胞中的細胞色素c含量較高. 當加入順鉑作用4 h 和8 h后,I750/I1660的比值顯著降低, 說明細胞內的細胞色素c含量降低; 繼續延長作用時間,I750/I1660的比值繼續減小; 作用48 h后該比值趨于零, 表明細胞色素c基本消失. 因此, 通過拉曼成像研究, 可以根據細胞內細胞色素c的含量和分布, 靈敏地判斷細胞是否發生凋亡, 以及凋亡的程度, 并且可以同時觀察細胞在凋亡過程中蛋白質、 脂質等的動態變化, 這對研究細胞的早期凋亡機制具有重要意義. 而常規MTT實驗由于只能宏觀地評估細胞活性, 因此在藥物作用的短時間內, 無法通過MTT實驗統計結果說明藥物是否開始誘導細胞凋亡, 因此, 拉曼成像法對研究單細胞凋亡過程具有獨特的優勢.

3 結 論

通過拉曼成像技術研究了順鉑誘導細胞凋亡過程中, 細胞內相關生物分子的含量變化與分布形態. 拉曼成像結果表明, 宮頸癌CaSki細胞與順鉑作用后, 細胞色素c會從線粒體中釋放到細胞質中, 且隨著作用時間的延長, 細胞色素c的含量逐漸減少, 脂質發生氧化和聚集, 驗證了順鉑誘導細胞內產生活性氧而導致細胞凋亡的藥物機制. 在順鉑與宮頸癌Caski細胞作用短時間后, 細胞色素c與細胞內蛋白質的拉曼信號強度比會減小, 因此將細胞色素c作為細胞凋亡的標記分子, 可以獲得細胞凋亡早期的分子變化信息. 傳統細胞活性實驗(MTT法)結果表明, 順鉑作用CaSki細胞24 h后的IC50值為4 mmol/L, 但順鉑誘導細胞凋亡早期(8 h內), 作用時間與存活率時間相關性較差. 與MTT法的結果相比, 拉曼成像在研究藥物與細胞作用過程中具有更高的時空分辨率, 可以更靈敏地反映細胞凋亡早期生物分子的變化規律, 為研究藥物與細胞的作用機制提供了分子水平上的信息.

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(Ed.: S, Z, M)

Study on Apoptosis Process of CaSkiviaFast Line-scanning Raman Imaging?

? Supported by the National Basic Research Program of China(No.2013CB933703).

ZHANG Jinliang, MA Xin, XU Mengxi, ZONG Cheng*, REN Bin*

(StateKeyLaboratoryofPhysicalChemistryofSolidSurfaces,CollegeofChemistryandChemicalEngineering,XiamenUniversity,Xiamen361005,China)

Cisplatin-induced apoptosis of CaSki cell was studiedviaRaman imaging technique. Fast line-scanning Raman imaging method could reveal the high temporal and spatial information of biomolecules including cytochrome c, protein and lipid during the apoptosis process. The results indicate that the relative intensity of cytochrome c to protein(I750/I1660) could reflect the stage of apoptosis. Compared with the traditional methylthiazoletetrazolium(MTT) method, Raman imaging could investigate the apoptosis of single living cell at a much higher temporal resolution and provide the molecular fingerprint information for revealing the cell-drug interaction.

Cervical cancer; Cytochrome c; Apoptosis; Raman spectroscopy; Raman imaging; Methylthiazoletetrazolium(MTT) method

2016-04-20.

日期: 2016-06-27.

國家重點基礎研究計劃項目(批準號: 2013CB933703)資助.

10.7503/cjcu20160265

O657.37; O644

A

聯系人簡介: 任 斌, 男, 博士, 教授, 主要從事拉曼光譜、 電化學和單細胞研究. E-mail: bren@xmu.edu.cn

宗 鋮, 男, 博士, 主要從事拉曼光譜、 電化學和單細胞研究. E-mail: czong@xmu.edu.cn