海洋來源真菌Penicillimgrisefulvum中桔霉素類化合物的分離及抗菌活性

高 彤, 蔡思源, 許蘭蘭, 曹 飛, 朱華結(jié)

(藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點實驗室, 河北省藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室,河北大學(xué)藥學(xué)院, 保定 071002)

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海洋來源真菌Penicillimgrisefulvum中桔霉素類化合物的分離及抗菌活性

高 彤, 蔡思源, 許蘭蘭, 曹 飛, 朱華結(jié)

(藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點實驗室, 河北省藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室,河北大學(xué)藥學(xué)院, 保定 071002)

以海洋來源青霉真菌Penicillimgrisefulvum為研究對象, 采用硅膠、 C18柱和Sephadex LH-20凝膠柱層析等手段, 從中分離獲得3個桔霉素類化合物: 7-methyl-penicitrinone A(1), citrinin(2)和penicitrinone A(3), 其中化合物1為新化合物. 通過一維核磁共振譜(1D NMR)、 二維核磁共振譜(2D NMR)和高分辨質(zhì)譜(HR-ESI-MS)對化合物1的平面結(jié)構(gòu)和相對構(gòu)型進行確定, 并運用電子圓二色光譜(ECD)和量子化學(xué)計算方法確定了其絕對構(gòu)型. 抗菌活性測試結(jié)果表明, 化合物1對副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)表現(xiàn)出了較強的抑制活性(MIC=0.8 μmol/L), 高于陽性對照藥物環(huán)丙沙星的活性(MIC=1.3 μmol/L).

海洋真菌;Penicillimgrisefulvum; 桔霉素衍生物; 抗菌活性

海洋生物所處的高鹽、 高壓、 低溫及寡營養(yǎng)等特殊環(huán)境使之能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎和活性多樣的次級代謝產(chǎn)物. 海洋來源微生物, 特別是海洋真菌[1～4], 已成為藥物先導(dǎo)化合物研究的重要生物資源之一, 被認為是極具潛力的藥物開發(fā)資源[5,6]. 目前, 已經(jīng)從海洋來源的青霉屬真菌中分離得到青霉素類、 聚酮化合物、 萜烯、 桔霉素及其氨基酸衍生物等多種結(jié)構(gòu)類型的次級代謝產(chǎn)物[7], 如從青霉Penicilliumchrysogenum中分離得到青霉素[8], 從青霉Penicilliumsolitum中分離出美伐他汀及從青霉Penicilliumbrevicompactum中發(fā)現(xiàn)了霉酚酸等[9].

本文選擇海洋來源真菌灰黃青霉(Penicillimgrisefulvum)為研究對象, 從其中分離得到3個桔霉素類衍生物7-methyl-penicitrinone A(1), citrinin(2)和penicitrinone A(3), 其中化合物1是新化合物. 活性測試結(jié)果表明, 化合物1～3均顯示出不同程度的抗菌活性.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

所用試劑均為分析純. 菌株采自深圳大亞灣海域, 篩選出的真菌經(jīng)由北京三博遠志技術(shù)有限責任公司鑒定為灰黃青霉(Penicillimgrisefulvum), 該菌株的菌株編號為KT781166(見本文支持信息表S1).

MOS-450型圓二色光譜儀(法國Bio-logic公司); AA-55系列全自動旋光儀(英國Optical Activity 公司); Avance Ⅲ 600 MHz核磁共振儀(TMS為內(nèi)標, 德國Bruker公司); Micromass Q-TOF質(zhì)譜儀(ESI-MS, 美國Waters公司); MAT95XP型高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo公司); 紫外分光光度計(北京恒通瑞利公司); LC-20A型循環(huán)半制備色譜儀(日本島津公司); YRT-3型熔點儀(天津精拓儀器科技有限公司); 正相柱色譜硅膠(青島海洋化工); 凝膠Sephadex LH-20(美國Pharmacia公司); C18反相填料(日本YMC公司); GF254薄層色譜用硅膠(煙臺化學(xué)工業(yè)研究所).

1.2 實驗過程

1.2.1 真菌培養(yǎng) 真菌發(fā)酵培養(yǎng)基: 大米(100 g/瓶)+真菌二號培養(yǎng)基(100 mL/瓶). 真菌二號培養(yǎng)基組成: 甘露醇(20 g/L)+酵母膏(3 g/L)+MgSO4·H2O(0.3 g/L)+味精(10 g/L)+葡萄糖(10 g/L)+KH2PO4(0.5 g/L)+麥芽糖(20 g/L)+玉米漿(1 g/L), 調(diào)節(jié)pH為6.5～7.0. 共發(fā)酵40瓶, 室溫下培養(yǎng)43 d.

1.2.2 提取和分離 將每瓶菌絲體用二氯甲烷/甲醇(體積比1∶1)溶液浸泡, 超聲提取5次, 減壓濃縮成浸膏(300.0 g), 再用乙酸乙酯萃取到無色, 得到乙酸乙酯相(166.3 g). 將乙酸乙酯相過減壓正相硅膠柱, 以石油醚/乙酸乙酯(體積比分別為100∶1, 80∶1, 50∶1, 20∶1, 5∶1和1∶1)溶液為流動相進行梯度洗脫, 用薄層色譜板檢測得到6個組分Fr.1～Fr.6. 組分Fr.5采用重結(jié)晶方法得到化合物2(23.0 mg); 組分Fr.3經(jīng)C18柱[V(甲醇)∶V(水)=4∶1]、 硅膠柱[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=30∶1]以及高效液相色譜[V(甲醇)∶V(水)=4∶1]分離得到化合物1(5.0 mg); 組分Fr.4經(jīng)過Sephadex-LH-20(甲醇)、 硅膠柱[V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=20∶1]及高效液相色譜[V(甲醇)∶V(水)=19∶1]分離得到化合物3(10.0 mg).

1.2.3 抗菌活性測試 測試了分離所得化合物的活性. 首先對致病細菌傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、 鰻弧菌(Vibrioanguillarum)和副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)進行培養(yǎng), 然后將致病細菌接種到PYG培養(yǎng)基[葡萄糖(20 g/L)+蛋白胨(10 g/L)+酵母膏(10 g/L)]并培養(yǎng)活化12 h, 吸取10 μL至PYG空白培養(yǎng)基中進行稀釋. 用無菌移液槍將96孔板的第一排加入198 μL菌液和2 μL樣品, 其它孔加入100 μL菌液, 將第一排的樣品和菌液混勻, 吸取100 μL依次向下加, 進行2倍遞減梯度稀釋, 最后補至200 μL, 使第一排樣品濃度為25 μmol/L, 測定最小抑菌濃度. 最后3列為環(huán)丙沙星陽性對照、 空白對照及DMSO陰性對照.

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物結(jié)構(gòu)解析

化合物7-methyl-penicitrinone A(1)為橙黃色粉末, 易溶于甲醇, [α]20D=+48.0°(c1.5, CH3OH); ESI-MS,m/z: 395.3[M+H]+; HRESI-MS,m/z: 395.1853[M+H]+, 分子式C24H26O5, 不飽和度為12; UV,λ/nm: 208, 252, 288. 由1H NMR譜數(shù)據(jù)(表1)可知, 化合物1存在7個甲基信號, 其中有3個甲基連接在芳香碳上; 還存在4個次甲基及1個連接苯環(huán)的羥基. 由13C NMR譜數(shù)據(jù)(表1)可知, 化合物1存在12個烯屬碳信號和1個羰基碳信號. 根據(jù)文獻[10]報道, 該化合物與桔霉素衍生物pennicitninone A(3)的結(jié)構(gòu)十分相似, 化合物1與化合物pennicitninone A(3)的不同之處僅在于在化合物1中多出1個甲基信號.

在化合物1的HMBC譜(圖1)中, 7-Me與C6, C7和C8之間存在相關(guān)信號, 表明該甲基連接于C7位. 通過1H-1H COSY, HMQC和HMBC進一步確定了該化合物的平面結(jié)構(gòu). 由化合物1的NOESY數(shù)據(jù)可知, 2′-H與3′-Me之間以及3′-H與2′-Me之間存在相關(guān)信號, 表明2′-H和3′-H處于化合物平面的異側(cè); 此外, 3-H與4-Me之間以及4-H與3-Me之間存在相關(guān)信號, 表明3-H和4-H也處于化合物平面的異側(cè). 以上結(jié)果表明, 化合物1與化合物3具有相同的相對構(gòu)型, 同時結(jié)合文獻[10]報道, 化合物1中2′-H和3′-H之間的耦合常數(shù)為3.6, 表明化合物1相對構(gòu)型的正確性. 化合物1的質(zhì)譜及核磁譜圖如圖S1～圖S8所示(見本文支持信息).

化合物1的絕對構(gòu)型通過圓二色光譜(ECD)實驗值與計算值[11～15]的比較來確定. 首先利用軟件通過分子動力學(xué)力場MMFF94S方法對分子(2′R,3′S,3R,4S)-1進行構(gòu)象搜索, 共得到6個能量最低構(gòu)象(ΔE=0～12.552 kJ/mol), 對該6個構(gòu)象分別在B3LYP/6-311+G(d)基組水平上進行優(yōu)化計算, 對優(yōu)化后的6個構(gòu)象再在B3LYP/6-311++G(2d,p)基組上進行ECD計算[16], 通過玻爾茲曼加合來擬合ECD譜圖. 通過比對實驗ECD譜與計算ECD譜(圖2)發(fā)現(xiàn), 兩者之間吻合較好, 表明化合物1的絕對構(gòu)型為(2′R,3′S,3R,4S). 化合物1的計算ECD數(shù)據(jù)和實測ECD數(shù)據(jù)見表S2和表S3(見本文支持信息).

Table 1 1H NMR, 13C NMR and HMBC data of compound 1

Fig.1 Structures of compounds 1—3 and key HMBC and COSY of compound 1

Fig.2 Calculated and experimental ECD spectra of compound 1

化合物2: 橙黃色針狀結(jié)晶, m. p. 173.2～174.3 ℃(文獻值[17]: 175～177 ℃), [α]20D=-15.0°(c2.0, CH2Cl2), 分子式C13H14O5, ESI-MS,m/z: 251[M+H]+. 以上數(shù)據(jù)與文獻[17～20]報道一致, 因此鑒定為citrinin. 其核磁譜圖見圖S9和圖S10(見本文支持信息).

化合物3: 黃色粉末, m. p. 150.4～151.7 ℃(文獻值[10]: 150～152 ℃), [α]20D=+140.0°(c2.0, CH2Cl2), 分子式C23H24O5, ESI-MS,m/z: 381[M+H]+. 以上數(shù)據(jù)與文獻[10,21]報道一致, 因此鑒定為penicitninone A. 其核磁譜圖見圖S11和圖S12(見本文支持信息).

2.2 抗菌活性

測定了3個化合物分別對致病細菌傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)、 鰻弧菌(Vibrioanguillarum)和副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)的活性, 結(jié)果如表2所示, 化合物1對副溶血性弧菌表現(xiàn)出很強的抑菌活性, 最低抑菌濃度為0.8 μmol/L, 化合物2和3對傷寒沙門氏菌的抑菌活性顯著, 最低抑菌濃度均為0.4 μmol/L. 化合物1～3的抗菌活性均高于對照藥環(huán)丙沙星.

Table 2 Antibacterial Activities of compounds 1—3(MIC, μmol/L)

3 結(jié) 論

通過對灰黃青霉固體發(fā)酵, 并用二氯甲烷/甲醇(體積比1∶1)溶液浸泡和乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯相, 經(jīng)柱層析分離得到3個化合物, 通過結(jié)構(gòu)解析和鑒定確定為7-methyl-penicitrinone A(1), citrinin(2)和penicitrinone A(3), 其中化合物1是新化合物. 化合物1～3均表現(xiàn)出很強的抗菌活性.

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20160315.

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(Ed.: P, H, S, K)

Citrinin Derivatives from Marine-derived FungusPenicillimGrisefulvumand Antibacterial Activity?

? Supported by the Science and Technology Support Project of Baoding, China(No.15ZN020), the Scientific Rsearch Foundation of Hebei Educational Committee, China(No.QN2016177) and the Financial Support from the Hebei University, China.

GAO Tong, CAI Siyuan, XU Lanlan, CAO Fei*, ZHU Huajie*

(KeyLaboratoryofMedicinalChemistryandMolecularDiagnosis,MinistryofEducation,KeyLaboratoryofPharmaceuticalQualityControlofHebeiProvince,CollegeofPharmaceuticalSciences,HebeiUniversity,Baoding071002,China)

The marine fungusPenicillimgrisefulvumwas cultivated with 43 d at 28 ℃, bioassay-guide fractionation of the marine fungusPenicillimgrisefulvumled to the isolation of three citrinin derivatives(1—3), which were separated by silica gel column chromatography, C18column chromatography, Sephadex LH-20, and semi-preparative HPLC. Based on the HR-ESI-MS, 1D and 2D NMR, compounds 1—3 were assigned as 7-methyl-penicitrinone A(1), citrinin(2) and penicitrinone A(3), respectively. The absolute configuration of compound 1 was determined by comparision of experimental and calculated electronic cicular dichroism(ECD) data. Compound 1 displayed strong antibacterial activity againstVibrioparahemolyticus(MIC=0.8 μmol/L), which was stronger than the positive control of ciprofloxacin(MIC=1.3 μmol/L).

Marine fungus;Penicillimgrisefulvum; Citrinin derivative; Antibacterial activity

2016-05-06.

日期: 2016-06-27.

保定市科技支撐項目(批準號: 15ZN020)、 河北省教育廳資助科研項目(批準號: QN2016177)和河北大學(xué)人才引進項目資助.

10.7503/cjcu20160315

O629.9

A

聯(lián)系人簡介: 曹 飛, 男, 博士, 講師, 主要從事海洋天然藥物研究. E-mail: caofei542927001@163.com

朱華結(jié), 男, 博士, 教授, 主要從事手性藥物化學(xué)研究. E-mail: zhuhuajie@hotmail.com