芒柄花黃素對人胃癌細胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及機制研究*

董陳誠,鐘 漓,張廣鈺,王振冉,冉福林,陳 霄

(桂林醫學院附屬醫院胃腸外科，廣西桂林 541002)

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論著·基礎研究

芒柄花黃素對人胃癌細胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及機制研究*

董陳誠,鐘 漓△,張廣鈺,王振冉,冉福林,陳 霄

(桂林醫學院附屬醫院胃腸外科，廣西桂林 541002)

目的 研究芒柄花黃素對人胃癌細胞MKN-45荷瘤裸鼠模型的抑制作用及作用機制。方法 建立人胃癌MKN-45細胞荷瘤裸鼠癌癥模型，經環磷酰胺(20mg/kg)和芒柄花黃素(10、20、40mg/kg)干預14d，觀察荷瘤重量變化及應用TUNEL染色評估荷瘤組織中細胞凋亡數量，并用蛋白免疫印跡法(Westernblot)檢測荷瘤內源性p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)及細胞周期蛋白(CyclinD)表達。結果 與模型對照組比較，芒柄花黃素明顯抑制胃癌細胞MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤的生長(P<0.01)，并且腫瘤組織中細胞凋亡計數增加(P<0.01)。同時，芒柄花黃素干預組腫瘤組織中的p38MAPK蛋白表達增加,CyclinD蛋白水平減少 (P<0.01)。結論 芒柄花黃素具有明顯抑制胃癌細胞MKN-45增殖作用，其機制與激活細胞內MAPK信號轉導通路而誘導細胞凋亡有關。

芒柄花黃素；胃腫瘤；細胞凋亡

胃癌病死率較高，是僅次于食道癌的常見惡性腫瘤之一[1]。當前，胃癌治療一般采用手術、放射或化學療法，但進展期胃癌的單純手術治療可能會存在肉眼或鏡下殘留灶，使復發轉移率大大增加[2]。目前臨床上使用的烷化劑類抗腫瘤藥環磷酰胺，在肝微粒體酶系催化下代謝轉化為烷化作用更強的氯乙基磷酰胺，能發揮細胞毒作用而殺滅腫瘤細胞，但其有著毒副作用較大的缺點[3]。近年發現，細胞內促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路與調控細胞增殖、分化和細胞凋亡密切相關，因此抑制該信號通路是藥物抗癌作用的新導向[4]。芒柄花黃素，又名刺芒柄花素，具有抗癌藥理活性，可防治前列腺癌及乳腺癌等癌癥，同時具有降血脂和抗氧化作用[5]。本實驗首先建立人胃癌細胞MKN-45荷瘤裸鼠動物模型，然后探討芒柄花黃素對胃腫瘤細胞的抗增殖活性，進而闡明其抗癌作用機制并為今后的臨床開發利用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 MKN-45人胃癌細胞株購自中科院上海細胞生物所細胞庫。將MKN-45培育在DMEM培養基(含10%胎牛血清，150 U/mL青霉素和120 U/mL的鏈霉素)，于5%CO2、37 ℃條件下培養。雄性BALB/c裸鼠，18～20 g，購自廣東省醫學實驗動物中心。動物飼養在良好的實驗控制環境中，標準化的飼料喂養和科學化的管理。

1.2 藥物與試劑 芒柄花黃素(純度大于98.0%)：上海佳和生物科技有限公司。環磷酰胺：江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。DMEM培養基：美國Gibico公司。胎牛血清：美國Gibico公司。胰蛋白酶：上海Sigma-Aldrich公司。TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒：上海碧云天生物技術研究所。DAB(3，3-二氨基聯苯胺)染色試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司。p38分裂原激活的蛋白激酶(p38MAPK)、細胞周期蛋白(CyclinD)及磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)：上海Sigma-Aldrich公司。蛋白裂解液:上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 主要儀器 HWS-150恒溫培養箱(上海森信實驗儀器有限公司)。 Series8000 直熱式CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)。W-CJ-1CU雙人單面水平超凈工作臺(南京萊步儀器有限公司)。SpectraMax 190全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)。 DM IRB(型號)倒置顯微鏡(德國Leica儀器有限公司)。ECL(電子化學發光)檢測系統(美國Thermo Scientific公司)。GelDoc 2000 伯樂凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 荷瘤動物與藥物干預 將0.1 mL無菌MKN-45細胞(3×107個/mL)皮下注射到裸鼠體內，觀察腫瘤生長情況。當移植腫瘤長到直徑約20 mm時，MKN-45荷瘤裸鼠被分為5組：模型對照組，環磷酰胺(20 mg/kg)陽性組和芒柄花黃素(10、20、40 mg/kg)給藥組，每天腹腔注射1次，持續14 d。同時記錄實驗裸鼠體質量(W)與腫瘤質量，并計算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率(%)=(1-W給藥/W模型)×100%。

1.4.2 指標檢測 分離皮下肝癌腫瘤組織，應用TUNEL染色評估腫瘤組織中細胞凋亡數，并用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測腫瘤內源性p38MAPK及CyclinD蛋白的表達。實驗步驟操作均按照試劑供應商說明書嚴格進行。

2 結 果

2.1 芒柄花黃素對荷瘤裸鼠腫瘤增殖的影響 實驗結果表明，芒柄花黃素能抑制胃癌細胞MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤的生長，隨著芒柄花黃素濃度的增加腫瘤質量不斷減小，呈劑量依賴性，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 芒柄花黃素抑制MKN-45荷瘤裸鼠 腫瘤增殖

*：P<0.01，與對照組比較。

2.2 芒柄花黃素對荷瘤裸鼠腫瘤組織細胞凋亡的影響TUNEL染色結果顯示，MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤組織中模型對照組TUNEL陽性細胞數量較少。而芒柄花黃素(10、20、40mg/kg)組，TUNEL陽性細胞計數隨濃度逐漸增加，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表2 芒柄花黃素增加MKN-45荷瘤裸鼠腫瘤組織TUNEL陽性細胞數量

*：P<0.01，與對照組比較。

2.3 芒柄花黃素對荷瘤裸鼠腫瘤組織CyclinD及p38MAPK蛋白表達的影響Westernblot結果表明，MKN-45荷瘤裸鼠內源性p38MAPK表達較低，處于抑制其表達狀態，而CyclinD蛋白表達較高。經芒柄花黃素干預后，腫瘤組織中p38MAPK蛋白表達明顯上調，而CyclinD蛋白水平明顯減少，與對照組比較差別有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

*：P<0.01，與對照組比較。

圖1 芒柄花黃素增加荷瘤裸鼠腫瘤組織p38MAPK水平及下調CyclinD表達

3 討 論

目前，胃癌的病因至今未被完全闡明，但與直接或長期破壞胃黏膜屏障導致促癌因子被激活有關[6]。在癌變發展中，癌細胞失控生長會逐漸形成惡性癌，并進一步侵入附近組織[7]。目前的臨床化療藥物療效有限，并有很大的毒副作用。因此，尋找能抑制腫瘤生長并且高效低毒的藥物一直是近年研究的熱點。

在本研究中，以環磷酰胺和芒柄花黃素作用于MKN-45荷瘤裸鼠模型，結果相比MKN-45荷瘤裸鼠模型對照組，環磷酰胺和芒柄花黃素組的荷瘤裸鼠腫瘤組織減小，且腫瘤增殖抑制率與芒柄花黃素的劑量成正比，說明了芒柄花黃素能有效發揮抗腫瘤細胞增殖作用。在接下來的腫瘤組織TUNEL染色實驗中作者發現，MKN-45荷瘤裸鼠模型對照組TUNEL陽性細胞計數顯著減少，而環磷酰胺和芒柄花黃素組TUNEL陽性細胞數量增多，并且呈劑量依賴性，這與上述實驗結果相一致，提示芒柄花黃素可能是通過誘導MKN-45細胞凋亡而抑制其增殖。

研究表明，p38MAPK激活時發生核轉移，啟動蛋白激酶和轉錄因子的磷酸化，同時p38通路介導的細胞凋亡過程通過細胞周期起作用，因此p38信號通路與細胞增殖、分化及細胞凋亡密切相關[8]。而CyclinD是調控細胞周期關鍵蛋白之一，當其過度表達可縮短G1期，并減少細胞對生長因子的依賴性。研究發現，CyclinD在人胃癌細胞中的表達較高，同時其陽性表達與癌癥的惡性程度呈正相關性，其中CyclinD通過調控細胞內MAPK途徑發揮負性調控作用，促進胃癌細胞的生長和轉移趨勢[9]。因此，調控腫瘤細胞內的MAPK信號通路或減少CyclinD表達有助于控制胃癌的發生、發展[10-11]。本研究的實驗結果與以上的研究成果是相一致的。本研究中，經10、20、40mg/kg濃度的芒柄花黃素干預后，裸鼠腫瘤組織中p38MAPK蛋白水平明顯上調，而CyclinD蛋白水平降低，腫瘤增殖受到明顯抑制，因此筆者推測芒柄花黃素抑制胃癌細胞MKN-45增殖活性與激活細胞內MAPK信號通路而介導細胞凋亡有關。

綜上所述，通過本研究，證明了芒柄花黃素能抑制胃癌細胞MKN-45生長，其作用機制與激活細胞內MAPK信號通路而介導細胞凋亡有關，為下一步臨床應用于胃癌的治療提供了理論基礎。

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Inhibitory effect and mechanism of formononetin on nude mouse model bearing human gastric cancer cells MKN-45*

DongChencheng,ZhongLi△,ZhangGuangyu,WangZhenran,RanFulin,ChenXiao

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity，Guilin，Guangxi541002，China)

Objective To investigate the inhibitory effect of formononetin on the nude mouse model bearing human gastric cancer cells MKN-45 and its possible mechanism.Methods The nude mouse cancer model bearing human gastric cancer cells MKN-45 was established.Then the weight change of tumor bearing mouse was observed after 14 d intervention by 20 mg/kg of cyclophosphamide and 10,20,40 mg/kg of formononetin.The cellular apoptosis count was evaluated by using the TUNEL staining method.The endogenous p38MAPK and CyclinD protein expressions in tumor tissue were determined through the Western blot assay.Results Compared with model control group,formononetin significantly inhibited the growth of nude mouse bearing gastric cancer cells MKN-45 (P<0.01),moreover the cellular apoptotic count was increased (P<0.01).Meanwhile,expression of P38MAPK protein in the tumor tissue of formononetin intervention group was increased and the CyclinD protein level was decreased (P<0.01).Conclusion Formononetin has obviously inhibitory effect on the proliferation of gastric cancer cells MKN-45,its mechanism may be related with the activation of intracellular MAPK signal transduction pathway and inducing cellular apoptosis.

formononetin;gastric neoplasms;cellular apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.006

廣西高校科學技術研究項目(LX2014270)。 作者簡介：董陳誠(1981-)，副主任醫師，碩士，主要從事胃腸腫瘤外科的研究。△

E-mail：zhongli0302@163.com。

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1671-8348(2016)32-4482-02

2016-05-18

2016-08-06)