VGX-1027對光滑念珠菌刺激大鼠氣道上皮細胞IL-1β和TNF-α表達影響的研究*

王玉春，張 雪，駱雪萍△

(桂林醫學醫學院第二附屬醫院：1.檢驗科；2.重癥醫學科，廣西桂林 541199)

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論著·基礎研究

VGX-1027對光滑念珠菌刺激大鼠氣道上皮細胞IL-1β和TNF-α表達影響的研究*

王玉春1，張 雪2，駱雪萍2△

(桂林醫學醫學院第二附屬醫院：1.檢驗科；2.重癥醫學科，廣西桂林 541199)

目的 探討未加免疫抑制劑VGX-1027大鼠氣道上皮細胞(RTEC)與加入VGX-1027的RTEC分別與光滑念珠菌孵育后炎癥因子IL-1β和TNF-α表達及意義。方法 以體外培養未加VGX-1027孵育的RTEC(未加組)和加入VGX-1027孵育的RTEC(加入組)，分別與光滑念珠菌孵育3、6、9 h，觀察未加和加入組RTEC形態變化；Real time PCR檢測未加和加入組IL-1β和TNF-α mRNA表達；ELISA檢測未加和加入組IL-1β和TNF-α分泌。未與光滑念珠菌孵育并未加VGX-1027的RTEC為對照組。結果 隨孵育時間延長，IL-1β和TNF-α 表達呈進行性增高，未加組與加入組相比，未加組IL-1β和TNF-α 表達更高。相同時間點，未加組與加入組比較IL-1β和TNF-α 表達均差異有統計學意義(P<0.05)。結論 RTEC可識別光滑念珠菌啟動天然免疫，并激活下游炎癥因子IL-1β和TNF-α的分泌，介導炎癥反應，但是過度的炎癥反應不能起到保護作用反而加重損傷。

光滑念珠菌；大鼠氣道上皮細胞；VGX-1027；腫瘤壞死因子α；白細胞介素1β

近年，由于未能控制的重癥感染誘導大量炎癥因子的釋放，使機體發生失控的自我持續放大和自我破壞的全身性炎癥反應。全身炎癥反應綜合征(SIRS)與代償性抗炎反應綜合征(CARS)的失衡是多器官功能障礙綜合征(MODS)的主要發病機制[1]。其中，重癥監護病房(ICU)患者由于光滑念珠菌等真菌感染導致菌血癥和膿毒敗血癥從而引起大量炎癥因子的釋放，使炎癥反應失衡而死亡[2]。本研究通過培養未加免疫抑制劑N-乙酰-3,5-二碘-L-酪氨酸(VGX-1027)[3]的大鼠氣道上皮細胞(RTEC)和加入VGX-1027的RTEC分別與光滑念珠菌孵育，探討在免疫調節劑作用下，光滑念珠菌對RTEC刺激下加入組和未加組炎癥因子白細胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達及影響。

1 材料與方法

1.1 材料 RTEC購于北京協和細胞資源中心。DMEM F12 1∶1混合培養傳代，培養條件37 ℃、5%CO2。標準光滑念珠菌，購自上海酶聯生物科技有限公司。接種沙堡培養基37 ℃培養48 h，挑菌落在高溫高壓滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，配成懸液，顯微鏡計數，無菌PBS重懸，4 ℃存備用。

1.2 方法

1.2.1 RTEC與光滑念珠菌孵育實驗

1.2.1.1 孵育前準備 細胞用胰酶消化、離心、計數，調整密度5×105/mL，每孔1 mL細胞懸液分別加入6孔板，培養24 h。

1.2.1.2 孵育實驗及分組 稀釋菌液，計數，調整濃度5×106/mL，每孔100 μL菌液，孵育復數(MOI)為1[4]。向六孔板任意一孔加菌液后，每間隔3 h，從其他六孔板任選一孔加菌液，共加3次，分別標記未加(VGX-1027孵育)3、6、9 h組。從剩余孔中選取1孔，未與光滑念珠菌孵育并未加VGX-1027的RTEC標記對照組。

1.2.1.3 加入抑制劑VGX-1027 按照1.2.1.1操作后，調整VGX-1027濃度為1 mg/mL[3]分別加入每1個孔，隨機選取3個孔按照1.2.1.2操作加菌液，標記加入3、6、9 h組。

1.2.2 熒光定量PCR 檢測IL-1β和TNF-α 終止孵育，收集細胞加入1 mL Trizol，按說明書提取RNA配制逆轉錄體系，合成cDNA第一鏈。IL-1β引物序列如下，上游：5′-ACC TGG TAG AAG TGA TGC C-3′，下游：5′-CAA GGA GTT GTT TCC GTT A-3′；TNF-α引物序列如下，上游：5′-CAC CAC GCT CTT CTG TCT ACT-3′，下游：5′-AGA TGA TCT GAG TGT GAG GGT C-3′；β-acting引物序列如下，上游：5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3′，下游：5′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3′。Real time PCR 反應條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，59 ℃ 20 s，72 ℃ 2 s，40循環。

1.2.3 上清液ELISA 檢測IL-1β和TNF-α 終止孵育，分別取100 μL上清液，按說明進行，繪制曲線，計算出IL-1β和TNF-α表達水平。

2 結 果

2.1RTEC光鏡觀察

2.1.1 未加組的RTEC光鏡觀察 對照組RTEC形狀完整、結構清晰(圖1A)；未加3、6、9h組(圖1B、C、D)可見，RTEC形狀變異、邊緣模糊、結構不完整，未加3h組與對照組比較，未加6h組與未加3h組比較，未加9h組與未加6h組比較，光滑念珠菌菌群數量逐漸增多，細胞碎片、溶解現象更明顯。

2.1.2 加入組的RTEC光鏡觀察 由1圖E、F、G可見，加入3h組與未加3h組比較、加入6h組與未加6h組比較、加入9h組與未加9h組比較發現，加入組RTEC形狀、結構和完整性均比未加入組損傷減輕，細胞變異減少，隨時間延長光滑念珠菌數量逐漸增多，但細胞碎片和細胞溶解現象比未加組明顯減少。

A:對照組；B:未加3h組；C：未加6h組；D:未加9h組；E：加入3h組；F：加入6h組；G:加入9h組。

圖1RTEC與光滑念珠菌孵育光鏡觀察(×20)

2.2IL-1β和TNF-αmRNA熒光定量PCR結果

2.2.1 未加3、6、9h組與光滑念珠菌孵育后IL-1β和TNF-αmRNA表達 未加3h組與對照組比較、未加6h組與未加3h組比較、未加9h組與未加6h組比較，IL-1β和TNF-αmRNA表達均明顯增高。

2.2.1.1 未加3、6、9h組IL-1βmRNA表達 未加3h組(2.498 5± 0.120 5)與對照組(1.000 0±0.000 0)比較，差異有統計學意義(P<0.05)；未加6h組(3.898 1± 0.141 1)與未加3h組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；未加9h(5.942 1±0.110 7)與未加6h組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2.1.2 未加3、6、9h組TNF-αmRNA表達 未加3h組與對照組(1.000 0± 0.000 0)比較，差異有統計學意義(P<0.05)；未加6h組(6.298 9± 0.109 7)與未加3h組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；未加9h組(8.785 7±0.517 3)與未加6h組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.2.2 加入與未加3、6、9h組的RTEC與光滑念珠菌孵育后IL-1β和TNF-αmRNA表達水平 相同時間，加入組IL-1β和TNF-αmRNA的表達降低(P<0.05)，尤其是加入9h組與未加9h組相比，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2、3和表1、2。

圖2 加入VGX-1027組與未加組比較IL-1β mRNA表達

圖3 加入VGX-1027孵育組與未加組比較TNF-α mRNA表達

2.3ELISA檢測上清液中IL-1β和TNF-α分泌

2.3.1 未加3、6、9h組上清液IL-1β和TNF-α因子的分泌 未加3h組與對照組比較、未加6h組與未加3h組比較，未加9h組與未加6h組比較，IL-1β和TNF-α的表達顯著升高。

2.3.1.1 未加3、6、9h組上清液IL-1β因子表達 未加3h組(121.53±15.71)與對照組(64.75±8.03)比較差異有統計學意義(P<0.05)；未加6h組(272.94±7.72)與未加3h組比較差異有統計學意義(P<0.05)；未加9h組(412.55±19.05)與未加6h組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3.1.2 未加3、6、9h組上清液TNF-α表達 未加3h組(80.69±8.57)與對照組(50.97±2.74)比較差異有統計學意義(P<0.05)；未加6h組(139.13±15.78)與未加3h組比較差異有統計學意義(P<0.05)；未加9h組(307.79±18.81)與未加6h組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

2.3.2 加入與未加3、6、9h組上清液中IL-1β和TNF-α分泌比較 相同時間，加入組比未加組IL-1β和TNF-α的分泌均較低，尤其是9h組低表達更顯著(表3、4)。

表1 加入VGX-1027孵育組與未加組比較IL-1β mRNA表達

a：P<0.05，與加入3h組比較;b：P<0.05，與加入6h組比較;c：P<0.01，與加入9h組比較.

表2 加入VGX-1027孵育組與未加組比較TNF-α mRNA表達

a：P<0.05，與加入3h組比較;b：P<0.05，與加入6h組比較;c：P<0.01，與加入9h組比較。

表3 加入VGX-1027孵育組與未加組比較IL-1β分泌

a：P<0.05，與加入3h組比較;b：P<0.05，與加入6h組比較;c：P<0.01，與加入9h組比較。

表4 加入VGX-1027組與未加組比較TNF-α分泌

a：P<0.05，與加入3h組比較;b：P<0.05，與加入6h組比較;c：P<0.01，與加入9h組比較。

3 討 論

VGX-1027是一種異惡唑化合物，有很強的免疫調節特性，能針對體內外不同受體信號通路刺激抑制炎癥因子的分泌[5]。有研究表明，VGX-1027是一種有效的免疫調節劑，能降低促炎細胞因子如IL-1β、TNF-α和干擾素γ(INF-γ)等的分泌，并通過抑制細胞因子的炎性作用使細胞存活率顯著增加[3]，從而避免炎性-抗炎失衡對機體造成的嚴重損傷。對于ICU患者由于大量激素和免疫抑制劑的應用，真菌侵入機體發生侵襲性肺部真菌感染(IPFI)非常普遍[6]。嚴重的未能控制的真菌感染引起大量炎性細胞浸潤和炎癥介質釋放，使炎性介質和抗炎介質失衡造成嚴重的肺臟損傷最終導致死亡。本研究通過RTEC加入免疫抑制劑VGX-1027與光滑念珠菌孵育相同時間發現，信號通路下游炎癥因子IL-1β和TNF-α分泌與未加入組相比顯著減少。此時在顯微鏡下發現，加入組與未加入組相比，加入組細胞輪廓、形態、結構和完整性破壞情況比不加入組明顯減輕。由此可見，VGX-1027具有很強的免疫抑制性，可降低炎性介質IL-1β和TNF-α的分泌，減輕炎癥反應，避免失控的炎癥反應帶來的嚴重損傷。

當真菌入侵機體時，首先接觸氣道上皮細胞，氣道上皮細胞是抵抗真菌等病原微生物入侵機體的第一道防線[7]，也是抗病原微生物感染產生免疫應答的前哨細胞。以往氣道上皮細胞僅被認為是機械物理屏障，隨研究深入發現氣道上皮細胞表面存在許多特異的病原識別受體(PRRs)，如Toll樣家族受體[8]和C型凝集素受體(CLR)等，通過對真菌表面病原相關分子模式(PAMPs)識別啟動天然免疫，保護機體免受真菌侵襲[9]。PRRs通過特異識別PAMP后，活化信號通路，招募特異接頭蛋白如MyD88等，使下游炎癥和趨化因子釋放，發揮抗真菌感染作用[10-11]。Dubourdeau等[12]發現用分生孢子刺激小鼠能激活信號通路啟動天然免疫，誘導下游TNF-α和IL-1等分泌抗感染。又有研究發現，PRRs上調也可以促進炎癥因子如TNF-α等的分泌，增加抗感染作用[13]。本實驗研究同樣發現，光滑念珠菌與RTEC孵育能誘導下游炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達，未加組炎癥因子分泌比加入組多。其中，最明顯的現象是雖然未加3h組比加入3h組釋放的炎癥因子IL-1β和TNF-α明顯增多，但此時在顯微鏡卻發現與加入3h組相比未加3h組RTEC細胞形態、結構和完整性的損害相對較輕，細胞溶解和細胞碎片相對較少。由此可見，在真菌感染早期信號通路能啟動天然免疫，誘導下游炎癥因子如TNF-α和IL-1β的釋放，適度的炎癥反應能抗真菌感染。

然而隨著孵育時間的延長，下游的炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達逐漸增多，尤其在9h組。未加9h組比加入9h組IL-1β和TNF-α的分泌幾乎升高了一倍，但此時顯微鏡下發現，未加組與加入組相比未加組RTEC受到的損害不但沒有減輕反而加重。細胞形態結構的完整性均被嚴重破壞，細胞溶解、被吞噬現象越來越明顯，細胞碎片逐漸增多。張青等[14]研究也發現，IL-1β和TNF-α是SIRS主要的前炎癥細胞因子，當一個損害性刺激作用機體會誘導前炎癥因子的產生和釋放，“瀑布樣”效應開始啟動。患者血漿中前炎癥因子IL-1β和TNF-α等水平顯著升高，使機體的炎癥反應逐漸擴大，甚至失控。對于重癥患者在器官損害期，前炎癥細胞因子會顯著升高，導致組織損傷和器官功能障礙[15]。此時，重癥患者將加重病情甚至死亡。由此證明，過度失控的炎性因子釋放會產生瀑布級聯，引起機體失控的自我持續放大和自我破壞的全身性炎癥反應加重損傷。

綜上所述，RTEC能識別光滑念珠菌，通過信號轉導誘導下游炎性因子IL-1β和TNF-α的表達，從而啟動天然免疫抗真菌感染。適度的炎癥反應對機體起到保護作用，但失控的持續放大的炎癥反應對機體的損傷更為嚴重。因此，充分認識炎癥避免“二次打擊”可能為ICU重癥患者在治療方面提供了一個新的靶點。

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Study of effect of VGX-1027 on expression of IL-1β and TNF-α in rat tracheal epithelial cells stimulated by Candida glabrata*

WangYuchun1，ZhangXue2，LuoXueping2△

(1.DepartmentofClinicalLaboratory;2.DepartmentofICU,SecondAffiliatedHospitalofGuilinMedicalUniversity,Guilin,Guangxi541199,China)

Objective To explore the expression and significance of IL-1β and TNF-α in rat tracheal epithelial cells(RTEC)without adding immunosuppressant VGX-1027 and RTEC with adding VGX-1027 after co-culturing with Candida glabrata.Methods RTEC without and with VGX-1027 were respectively co-cultured with Candida glabrata bacteria liquid for 3,6,9 h.Then the morphological changes of RTEC were observed in the adding VGX-1027 group and non-adding VGX-1027 group;the mRNA expressions of IL-1β and TNF-α were detected by real-time PCR and secretion of IL-1β and TNF-α was determined by ELISA．Results With the culture time extending,the expression of IL-1β and TNF-α showed the progressive increase;the expressions of IL-1β and TNF-α in the non-adding VGX-1027 group were higher than those in the adding VGX-1027 group.At the same time point,the expressions of IL-1β and TNF-α had statistically significant difference between the non-adding VGX-1027 group and adding VGX-1027 group(P<0.05).Conclusion RTEC can recognize Candida glabrata to activate natural immunity and secretion of downstream inflammatory factors IL-1β and TNF-α,and mediates inflammatory reaction,but excessive inflammation can not play a protective effect,on the contrary aggravates damage.

Candida glabrata；rat tracheal epithelial cells；VGX-1027；tumor necrosis factor-α；interleukin-1beta

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.32.004

廣西醫療衛生重點科研課題(重2012007)；廣西自然科學基金項目(2013GXNSFAA019209)。 作者簡介：王玉春(1965-)，副主任技師，本科，主要從事重癥感染方面研究。△

R519.3

A

1671-8348(2016)32-4475-04

2016-04-03

2016-05-16)