雙重實時熒光RT-PCR法檢測腸道病毒方法的建立及應用*

許聯紅，岳玉林，王永仿，楚 鷹，蔣立新

(1.江蘇大學附屬武進醫院檢驗科,江蘇常州 213002；2.江蘇省南京市兒童醫院檢驗科 210008)

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雙重實時熒光RT-PCR法檢測腸道病毒方法的建立及應用*

許聯紅1，岳玉林2，王永仿1，楚 鷹1，蔣立新1

(1.江蘇大學附屬武進醫院檢驗科,江蘇常州 213002；2.江蘇省南京市兒童醫院檢驗科 210008)

目的 建立檢測腸道病毒(EV)和腸道病毒71型(EV71)的雙重實時熒光RT-PCR法。方法 設計特異性引物和探針，建立雙重實時熒光RT-PCR反應體系，繪制標準曲線，對該方法的靈敏度、精密度等進行評價。收集109例臨床手足口病患者糞便和咽拭子標本用該法進行檢測，并與EV71商品化試劑盒檢測結果進行比較。結果 雙重熒光PCR法建立的EV和EV71標準曲線相關系數(r)均為0.998；該法檢測EV和EV71的靈敏度分別達到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL；檢測EV和EV71的批內精密度均小于3%，總精密度均小于或等于4%；對腸道病毒及其他人類非腸道病毒進行檢測，顯示了良好的特異性。109例臨床樣本用該法檢測出84例EV病毒陽性樣本，其中EV71陽性56例，EV71總陽性率為51.4%；與單重熒光PCR商品化試劑盒的檢測結果完全一致(P=1.000)。結論 建立的雙重實時熒光RT-PCR法靈敏度高、穩定性好，對手足口病的早期高通量快速診斷具有重要意義。

手足口病；腸道病毒；腸道病毒71型；雙重實時熒光RT-PCR

手足口病(HFMD)是一種急性傳染病，由多種腸道病毒引起，多發生于5歲以下兒童，主要通過密切接觸或消化道傳播，基本臨床表現為手、足、口腔等部位出現皰疹，部分患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等多種與神經系統相關的疾病[1]。個別重癥患兒病情發展很快，最終可能導致死亡。引發HFMD的20多種腸道病毒中以EV71型最為常見。1969年Schmidt等[2]首次從加利福尼亞州患有中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出腸道病毒71型，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。EV71病毒主要通過糞-口傳播，且隱性感染者居多，因此易出現暴發流行[3-4]。該病已被我國定為乙類傳染病。快速、簡便、高敏感性的檢測方法對該病的預防控制極其重要。傳統的病毒分離培養、血清學方法等，步驟繁瑣，靈敏度不高，容易出現漏檢。本試驗擬通過建立一種雙重實時熒光RT-PCR方法，在完全閉管的條件下同步檢測通用型腸道病毒(enterovirus,EV)和EV71病毒，為臨床HFMD患者的早期診斷提供一種有效、快速的檢測手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2014年3月至2015年8月南京市兒童醫院住院HFMD患兒的109份治療前標本(糞便標本64份和咽拭子45份)。HFMD診斷標準參考中華人民共和國衛生部制定的2010年版《手足口病診療指南》。EV71/FY0805和EV71/BrCr病毒株由南京大學公共衛生中心實驗室提供。

1.2 儀器與試劑 病毒核酸提取試劑盒(江蘇碩世公司)，一步法熒光定量RT-PCR試劑盒(大連寶生物公司)，ABI7500熒光PCR儀(美國ABI公司)，腸道病毒71型核酸檢測試劑盒(中山大學達安基因公司)。

根據EV71的VP1區核酸序列和EV的5′UTR區核酸序列，用Primer Express3.0軟件設計特異性引物與TaqMan 探針，并對其進行BLAST 序列比對，驗證引物和探針的特異性。引物和探針序列見表1，均由上海生物工程公司合成。

表1 引物和探針序列

1.3 方法

1.3.1 病毒核酸的提取 糞便標本須加入適量生理鹽水(0.5 g糞便或0.5 mL液態糞便樣本加5 mL生理鹽水)，然后將懸液12 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液進行RNA抽提；咽拭子標本中加入1 mL生理鹽水充分攪動10次，取200 μL提取RNA；病毒細胞培養物直接取200 μL培養液用于抽提RNA。取上述各種標本200 μL于1.5 mL離心管中，加入600 μL 裂解液，震蕩混勻，室溫放置5 min；加入600 μL緩沖液震蕩混勻，混合液轉移至吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，去掉廢液，重復此操作直至轉移完；加入500 μL漂洗液，12 000 r/min離心1 min，去掉廢液，重復漂洗1次；12 000 r/min空柱離心2 min；將吸附柱放入1個干凈的1.5 mL離心管中，加入50 μL洗脫液靜置5 min，12 000 r/min離心1 min收獲純化的核酸溶液，-80 ℃冰箱保存備用。

1.3.2 雙重熒光RT-PCR檢測方法的建立 反應體系：2×PCR 緩沖液12.5 μL，5 U/μL Ex Taq酶0.5 μL，5 U/μL 逆轉錄酶(M-MLV)0.5 μL，20 μmol /L 上、下游引物各0.5 μL，10 μmol /L探針0.5 μL，總RNA 5 μL，DEPC水補足至25 μL。擴增條件:50 ℃ 30 min; 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s,55 ℃ 35 s，共45個循環，在55 ℃進行雙重熒光信號檢測。

1.3.3 雙重熒光RT-PCR法的靈敏度檢測 將EV71/FY0805病毒株培養液(病毒滴度為5×105TCID50/mL)10倍連續稀釋(5～0.005 TCID50/mL)，提取病毒RNA，按上述條件進行熒光定量RT-PCR，每個稀釋標本重復檢測10次。

1.3.4 雙重熒光RT-PCR法的精密度檢測 每天分析1個批次，2個濃度樣本(5×102和0.5 TCID50/mL)，每個樣本重復測定3 次，連續檢測5 d。參照文獻[5]計算批內精密度(CV批內)和總精密度(CV總)。

1.3.5 雙重熒光RT-PCR法的特異度檢測 應用雙重熒光RT-PCR法分別檢測EV71病毒株、柯薩奇病毒A16、埃可病毒、輪狀病毒和流感病毒。

1.3.6 雙重熒光RT-PCR法的臨床應用 應用雙重熒光RT-PCR法檢測收集的109例HFMD患者糞便和咽拭子樣品，并與腸道病毒71型核酸檢測試劑盒檢測結果進行比較。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行統計分析，計數資料用四格表資料的χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EV和EV71標準曲線建立 將EV71/FY0805病毒株培養液以10倍連續稀釋，提取病毒中的核酸(RNA)作為模板，按上述條件進行雙重實時熒光RT-PCR反應，分別得到相應熒光信號的EV和EV71特異性擴增曲線，見圖1。然后建立相對定量標準曲線，其中橫坐標為病毒滴度的log值，縱坐標為RT-PCR循環的Ct值，EV和EV71標準曲線的相關系數(r)均為0.998，見圖2。

EV71擴增曲線(a:5×104TCID50/mL,b:5×103TCID50/mL,c:5×102TCID50/mL,d:50TCID50/mL)。EV擴增曲線(e:5×104TCID50/mL,f:5×103TCID50/mL,g:5×102TCID50/mL,h:50TCID50/mL)。

圖1 EV和EV71雙重熒光PCR擴增曲線圖

圖2 EV71和EV標準曲線的建立

2.2 雙重熒光RT-PCR法的靈敏度 當病毒滴度為5和0.5TCID50/mL時，10次EV和EV71均能檢出；當滴度為0.05 TCID50/mL時，10次中有2次EV未檢出，EV71全部檢出；而當滴度為0.005 TCID50/mL時，EV均未檢出， EV71有1次未檢出。因此該方法檢測EV和EV71的靈敏度分別為0.5和0.05 TCID50/mL。

2.3 雙重熒光RT-PCR法的精密度 病毒滴度為5×102TCID50/mL時，EV71和EV檢測所獲得的Ct值批內精密度(CV批內)分別為2.1%和2.4%，總精密度(CV總)均為3.9%；病毒滴度為 0.5 TCID50/mL時，EV71和EV的批內精密度分別為2.7%和2.6%，總精密度分別為4.0%和3.5%，見表2。

2.4 雙重熒光PCR法的特異度 EV71/FY0805 和EV71/BrCr 病毒株通用型EV和EV71檢測結果均為陽性；柯薩奇病毒A16和埃可病毒EV檢測陽性，EV71結果陰性；而輪狀病毒和流感病毒二者皆為陰性，見表3。

表2 雙重熒光RT-PCR法的精密度檢測(Ct值)

表3 雙重熒光PCR法的特異度檢測

+：陽性；-：陰性。

2.5 雙重熒光RT-PCR法的臨床應用 對109份臨床HFMD患者樣品(其中糞便標本64份，咽拭子標本45份)利用雙重熒光RT-PCR和EV71單重熒光PCR商品化試劑盒進行檢測。通用型EV病毒在糞便中檢出陽性52例，咽拭子中檢出32例，總陽性率為77.1%(84/109)。糞便和咽拭子標本的EV71陽性率分別為56.25%(36/64)和44.4%(20/45)。雙重熒光RT-PCR法和EV71熒光PCR試劑盒檢測EV71總陽性率均為51.4%(56/109)，陽性和陰性符合率均為100%，檢測結果完全一致(P=1.000)，見表4。

表4 雙重熒光PCR法和單重熒光PCR試劑盒檢測EV71的結果比較

+:陽性；-：陰性。

3 討 論

傳統的檢測EV71病原體的方法有病毒分離培養、血清學方法和RT-PCR等。病毒分離培養是手足口病感染的實驗室診斷金標準，但對實驗室條件和操作人員技術要求嚴格，培養周期長，各個實驗室分離陽性率不同，病毒流行期間，不能同時處理大量樣本[6-7]。中和抗體檢測費時、費力，無法滿足快速、早期診斷的要求。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法可以檢測相應病毒特異性IgM抗體，操作簡便、特異、準確，適用于早期檢測，但在檢測低水平抗體時易出現假陰性，報道稱其和RT-PCR方法聯合檢測有助于提高HFMD的早期診斷[8-10]。病原微生物檢測已開始廣泛使用分子生物學技術，普通的RT-PCR技術雖然克服了以上缺點，已經成為快速診斷的重要手段，但PCR后需進行凝膠電泳分析，且系統開放，容易受環境因素發生交叉污染，造成假陽性，對疾病的診斷造成誤診[11-12]。

本研究建立的雙重實時熒光RT-PCR檢測方法，利用TaqMan技術，改善了單重熒光定量RT-PCR耗時長，成本高和多重高通量RT-PCR易發生污染、靈敏度和特異性較低的不足[13]。該檢測方法能在一個反應管中靈敏、特異地檢測并區分EV和EV71。EV71屬于EV 的一個亞型，利用RT-PCR 檢測EV71時，理論上不僅僅特異性的EV71探針應該呈現陽性曲線，EV 的通用型EV 探針也應該呈現陽性曲線，最后結果應該顯示為雙陽性曲線。若是在檢測EV71時僅僅只有特異性EV71 探針顯示陽性而EV探針顯示為陰性時，則該樣本需重新進行檢測。而對于EV陽性EV71陰性的標本提示患者是由其他腸道病毒引起，為明確病因需進一步進行其他腸道病毒檢測。

本研究結果顯示，雙重熒光PCR法建立的EV和EV71標準曲線相關系數均為0.998；檢測EV和EV71的靈敏度高，分別達到0.5 TCID50/mL和0.05 TCID50/mL；重復性好，批內精密度均小于3%，總精密度均小于或等于4%；特異性檢測顯示只有EV71樣本呈現EV和EV71雙陽性曲線，其他病毒標本均未出現特異性EV71陽性曲線，表明該法特異性強。臨床樣本檢測結果顯示，雙重熒光RT-PCR法通用型EV陽性檢出率為77.1%，EV71總陽性率為51.4%，與EV71商品化試劑盒的檢測結果完全一致(P=1.000)。以上結果表明雙重熒光RT-PCR法可以對EV和EV71進行穩定可靠的檢測。

本研究建立的雙重實時熒光RT-PCR法檢測腸道病毒快捷，靈敏度高，穩定性好，污染小，省時省力，能夠有效檢測手足口病患者感染的病原體，也可進行大規模流行病學調查。

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Establishment and application of dual real-time fluorescent RT-PCR method for detection of Enterovirus*

XuLianhong1,YueYulin2,ChuYing1,WangYongfang1,JiangLixin1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedWujinHospitalofJiangsuUniversity,Changzhou,Jiangsu213002,China； 2.DepartmentofClinicalLaboratory,NanjingMunicipalChildren′sHospital，Nanjing,Jiangsu210008，China)

Objective To develop a dual real-time fluorescent RT-PCR method for rapid detection of enterovirus(EV)and enterovirus type 71(EV71). Methods Specific primers and probes were designed and the dual real-time fluorescent RT-PCR reaction system was established. The quantitative standard curve was drawn; its sensitivity and precision were evaluated. Feces and throat swab specimens of 109 clinical patients with hand foot and mouth disease were collected and tested by using this method. Then the obtained results were compared with those detected by commercial EV71 PCR kit.Results The relative coefficient(2)of EV and EV71 standard curve established by the dual real-time fluorescent RT-PCR method were both 0.998. Its sensitivity reached 0.5 TCID50/mL for detecting EV and 0.05 TCID50/mL for detecting EV71. The within-run precision for detecting EV and EV71 was<3% and total precision≤4%. The results showed good specificity for the detection of enterovirus and non-enterovirus. In 109 detected clinical samples, 84 cases of EV positive samples were detected, in which 56 cases were EV71 positive with the total positive rate of 51.4%, which was consistent with the result of simple fluorescent RT-PCR commercialization kit(P=1.000).Conclusion The established dual real-time fluorescent RT-PCR method has high sensitivity and good stability, which has an important significance for early high throughput rapid diagnosis of hand foot and mouth disease.

hand foot and mouth disease; enterovirus;enterovirus71;dual real-time fluorescence RT-PCR method

?術與方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.026

江蘇省武進市科技發展計劃(WS201312)。 作者簡介：許聯紅(1981-)，碩士，主管技師，主要從事病原體分子生物學研究。

R512.5；Q93-33

A

1671-8348(2016)33-4688-03

2016-05-11

2016-07-21)