云南漢族γ-干擾素受體基因多態性與動脈粥樣硬化斑塊穩定性的相關性

楊天睿，撒亞蓮

(云南省第一人民醫院：1.內干科；2.基研室，昆明 650032)

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云南漢族γ-干擾素受體基因多態性與動脈粥樣硬化斑塊穩定性的相關性

楊天睿1，撒亞蓮2

(云南省第一人民醫院：1.內干科；2.基研室，昆明 650032)

目的 探討云南漢族γ-干擾素受體(IFNGR)的兩個氨基酸位點Val14Met和GIn64Arg多態性與動脈粥樣硬化(AS)斑塊穩定性的相關性。方法 收集該院2014年3月至2015年3月收治的AS斑塊不穩定的患者作為觀察組，而同期入院的AS斑塊穩定/無斑塊的患者為對照組。采集患者外周靜脈血，提取基因組DNA，通過聚合酶鏈反應(PCR)產物直接測序法檢測IFNGR1 Vall4Met和IFNGR2 Gln64Arg位點的基因型，采用DNAStar、GeneTool軟件分析測序結果，用流式細胞術檢測患者血漿細胞因子[γ-干擾素(IFN-γ)]的水平。結果 204例當地漢族患者列入研究，其中觀察組109例，年齡(76.89±12.08)歲；對照組95例，年齡(65.99±16.32)歲。IFNGR1 Vall4Met 位點在觀察組和對照組中均未發現多態性改變。IFNGR2 Gln64Arg在觀察組AA基因型頻率為51.95%(40/77)，AG基因型頻率為53.06%(52/98)，GG基因型頻率為58.62%(17/29)；對照組AA基因型頻率為48.05%(37/77)，AG基因型頻率為46.94%(46/98)，GG基因型頻率為41.38%(12/29)，卡方檢驗P=0.824，IFNGR2基因型AA、AG和GG與AS斑塊穩定性沒有關系；觀察組IFNGR2 A等位基因頻率為52.38%(132/252)，G等位基因頻率為55.13%(86/156)，對照組A等位基因頻率為47.62%(120/252)，G等位基因頻率為44.87%(70/156)，卡方檢驗校正P=0.661，IFNGR2等位基因A和G與AS斑塊穩定性沒有關系。經Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，該樣本人群該基因頻率符合遺傳平衡法則。觀察組血漿中IFN-γ水平為(4.60±1.91)ng/mL，對照組為(4.88±2.10)ng/mL，差異無統計學意義(P=0.318)；血漿IFN-γ水平與AS斑塊穩定性無相關性(P=0.308)。結論 IFNGR基因多態性不能作為AS斑塊穩定性的預警指標。

動脈粥樣硬化；γ-干擾素受體；基因；多態性

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是一種常見多發疾病，其斑塊的不穩定導致斑塊破裂、血栓形成及血管阻塞，是急性心、腦血管事件的主要原因，極大的威脅著人民群眾的生命健康，防治AS已成為當今醫學科學研究的重大課題。γ-干擾素(IFN-γ)是多功能細胞因子，是巨噬細胞、自然殺傷(NK)細胞、血管內皮細胞的活化劑，且具有阻止膠原蛋白合成，抗纖維化的作用。某些基因位點上的多態性會影響基因的轉錄效率和/或表達產物的功能，不同細胞因子發揮生物學功能均是通過與細胞膜表面受體相互作用最終促進靶基因的表達[1]，γ-干擾素表面受體復合物(IFNGR)基因多態性是否影響AS的發生及其斑塊穩定性尚不十分清楚，目前已發現的IFNGR多態性位點有IFNGR1 Vall4Met、IFNGR2 Gln64Arg，本研究針對本地區廣大漢族人群，通過用聚合酶鏈反應(PCR)產物直接測序檢測以上位點基因型，流式細胞術檢測外周血漿Th1型、Th2型細胞因子，探討炎癥介質在AS斑塊穩定性中的作用，為明確云南漢族IFNGR基因多態性是否影響AS斑塊穩定性提供理論依據，為早期、有效評估斑塊穩定性和預警急性心腦血管事件提供有效方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取云南省第一人民醫院內干科2014年3月至2015年3月收治的漢族患者204例，經頸動脈超聲檢查和相關臨床癥狀分為AS斑塊不穩定組(觀察組)和無斑塊/AS斑塊穩定組(對照組)。其中觀察組111例，男65例，女46例，年齡(76.89±12.08)歲；對照組97例，男57例，女40例，年齡(65.99±16.32)歲。

診斷標準為研究對象經頸動脈超聲檢查，發現內膜-中膜厚度(IMT)≥1.3 mm者即可做出頸動脈粥樣硬化斑塊的診斷。根據斑塊病理類型及超聲特點，將斑塊分為4型，即硬斑、軟斑、扁平斑和潰瘍斑。硬斑和扁平斑因表面有鈣鹽沉積，富含纖維組織屬穩定斑塊，而軟斑與潰瘍斑富含脂質及大量的炎性細胞，易脫落出血，屬不穩定斑塊。患者取頭后仰臥位，檢查一側頸動脈時頭偏向對側約45°，分別檢查左右頸動脈。探頭沿頸動脈走向，自下向上作連續縱、橫切面掃查。檢測部位包括:頸總動脈(CCA)的遠端(頸內、外動脈分叉水平連線下方1.0～1.5 cm),頸內動脈(ICA)起始部(分叉水平上方1.0～1.5 cm)和頸總動脈分叉(BIF)，頸外動脈(ECA)。觀察頸動脈IMT，有無斑塊，斑塊的形態、大小及性質，彩色血流顯像觀察血流是否通暢，色彩明暗程度，有無彩色血流充盈缺損。臨床表現中存在冠心病心絞痛、急性腦卒中患者為AS斑塊不穩定組(觀察組)。冠心病心絞痛診斷符合2012年中國《非ST段抬高型急性冠脈綜合征診斷和治療指南》，具有心絞痛典型癥狀。腦卒中患者具有明確的腦梗死影像學依據。

1.2 儀器與試劑 運用Philips-iu 22彩色超聲診斷儀進行頸動脈超聲檢查。全血基因組DNA提取試劑盒、PCR擴增和電泳所需試劑購自北京百泰克生物技術公司；細胞因子微球為BD公司TH1/TH2 cytokine kitⅡ試劑盒。Chemidoc XRS化學發光成像系統購自Bio-RAD，Nano Drop2000(ND2000)超微量分光光度計購自Thermo公司，PCR儀為Gene Amp PCR Systeerm 9700，高速冷凍離心機購自日本Hitachi-CR22G，BG-sub MIDI水平電泳儀購自Baygene公司；測序由碩陽科技生物技術公司完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 基因組的DNA提取及質量鑒定 依照全血基因組DNA提取試劑盒說明書逐步抽提基因組DNA。取2 μL用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量，其余分裝凍存于-60 ℃冰箱備用。用1.2%瓊脂糖凝膠檢測外周血DNA的質量，上樣2 μL，Marker為DL2000。

1.3.2 引物設計與合成 從Genebank下載序列，用GeneTool軟件設計引物。IFNGR1 Vall4Met引物為，F:5′-CAG CGA CCG TCG GTA GCA GC-3′，R:5′-GCC ACG AAC TGA GAC CAC GAT G-3′；擴增片段為722 bp。IFNGR2 Gln64Arg引物為，F:5′-ACC AGT AGG GCC ATC TTT GTA GC-3′,R:5′-TGC CAG TGT AGT TTA AGC CTT CAG-3′；擴增片段為531 bp。內參引物為，F:5′-GCC TTC CCA ACC ATT CCC TTA-3′；R:5′-TCA CGG ATT TCT GTT GTG TTT C-3′；擴增片段為426 bp。

1.3.3 目的片段的PCR擴增及其產物檢測分析 PCR擴增體系為20 μL，含2×Taq PCR Master Mix 10 μL，25 μmol/L上游、下游引物各0.25 μL，模板DNA 1 μL，IFNGR1 Vall4Met的擴增條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，63 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,32個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。擴增IFNGR2 Gln64Arg的退火溫度為60 ℃；擴增IFN-γ+2 109的退火溫度為52 ℃。取2 μL PCR擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。其余PCR產物送公司測序檢測目的片段序列。

1.3.4 PCR產物直接測序 測序引物與PCR擴增引物相同。對PCR產物用乙醇沉淀法純化，經Bigdye測序反應，用ABI 3730XL測序儀進行測序。 測序結果采用DNAStar、GeneTool軟件分析基因型。

1.3.5 流式細胞術檢測血漿細胞因子濃度 按試劑盒說明書進行流式細胞儀方案設計，繪制標準曲線。用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集患者外周靜脈血1～2 mL，3 000 r/min離心10 min，取0.5～1.0 mL血漿凍存備用。將50 μL血漿和50 μL微球混合液混合，1.5 h后加入T1染色液，孵育1.5 h后，加入Buffer，1 500 r/min離心10 min，去除上清液后加入Buffer,上流式細胞儀，根據分析軟件系統測定血漿中IFN-γ水平。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件進行數據整理和分析，計算各組的等位基因和基因型頻率。對樣本及基因型分布頻率 用Hardy - Weinberg遺傳平衡檢驗；計數資料的組間比較使用χ2檢驗，計量資料的組間比較使用t檢驗，與AS斑塊穩定性的相關性用相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Hardy - Weinberg遺傳平衡檢驗 為了確保資料的可靠性，對等位基因頻率進行了Hardy-Weinberg平衡定律檢驗(表1)。

2.2 目的片段的PCR擴增產物及測序分析 對204例患者的外周血DNA樣本進行PCR擴增，均擴增到特異性條帶，其片段大小與預期結果相符合(圖1、2)。

2.3 IFNGR1 Vall4Met、IFNGR2 Gln64Ar基因型頻率及等位基因頻率的比較 觀察組和對照組IFNGR1 Vall4Met均為野生型，位點未見突變。

2.3.1 IFNGR2 Gln64Arg AA、AG和GG 基因型與AS斑塊穩定性分析 觀察組IFNGR2 Gln64Arg的AA、AG、GG基因型的頻率分別為51.95%、 53.06%、58.62%，對照組AA、AG、GG基因型的頻率分別為48.05%、46.94%、41.38%，觀察組IFNGR2 Gln64Arg的AA、AG、GG基因型頻率與對照組比較，差異無統計學意義(P=0.824)，見表2。

表1 IFNGR2 A/G等位基因頻率Hardy-Weinberg平衡定律檢驗

A:電泳檢測IFNGR1的PCR擴增產物；B:IFNGR1 Vall4Met的反向測序圖 (CC基因型，野生型)。

圖1 PCR擴增產物直接測序檢測IFNGR1 Vall4Met

A：電泳檢測IFNGR2的PCR擴增產物；B:IFNGR2 Gln64Arg的正向測序圖 (AA基因型，野生型)；C：IFNGR2 Gln64Arg的正向測序圖 (AG基因型，雜合子);D：IFNGR2 Gln64Arg的正向測序圖(GG基因型，純合子)。

圖2 PCR擴增產物直接測序檢測IFNGR2 Gln64Arg

2.3.3 IFNGR2 Gln64Arg 等位基因A和G與AS斑塊穩定性的關系分析 觀察組IFNGR2 Gln64Arg的A、G等位基因頻率分別為52.38%和55.13%，對照組A、G等位基因頻率分別為47.62%和44.87%，觀察組IFNGR2 Gln64Arg的A、G等位基因頻率與對照組比較，差異無統計學意義(P=0.589),見表3。

2.4 流式細胞術檢測血漿IFN-γ的水平 觀察組血漿中IFN-γ水平為(4.60±1.91)ng/mL，對照組血漿中IFN-γ水平為(4.88±2.10)ng/mL，觀察組與對照組血漿IFN-γ水平比較，差異無統計學意義(P=0.318)。

表3 IFNGR2 A、G等位基因與AS斑塊穩定性(n)

2.5 血漿IFN-γ水平與AS斑塊穩定性的關系 Pearson相關分析顯示，血漿IFN-γ水平與AS斑塊穩定性無相關性(P=0.308)。

3 討 論

目前心血管疾病已經成為威脅人類健康的一大殺手，有研究顯示，心血管病的發病率和病死率已經超過了惡性腫瘤，每年全國有超過300萬人死于心血管疾病，且發病年齡呈現低齡化的趨勢。AS是冠狀動脈疾病、腦梗死等血管性疾病的病理基礎，因此，防治AS已成為防治心腦血管病的根本性戰略措施之一。AS的發病機制尚不十分清楚，有血栓形成學說、脂質浸潤學說、細胞因子學說、炎癥-損傷反應學說、病毒學說、受體缺失學說和癌基因學說等，但近年來大量的基礎和臨床研究支持AS是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病這一新看法[2-3]。IFN-γ是由免疫細胞分泌的多功能細胞因子，能增強抗原提呈、活化T淋巴細胞、巨噬細胞并促進其釋放炎性因子，協同其他致炎因子促進粥樣病灶處的炎性反應，加速病變進展[4]。另外，IFN-γ尚有阻止膠原蛋白合成的抗纖維化的作用[5]，這些是通過與特異的細胞表面受體復合物(IFNGR)結合而發揮作用。

人類DNA序列的變異以單核苷酸多態性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)為最常見的遺傳變異類型。某些位點上的基因多態性會影響基因的轉錄效率和/或表達產物的功能，并成為不同人群中一些疾病存在不同發病率或不同臨床表現、治療反應及預后的內在機制[6]。IFNGR是由配體結合鏈(IFNGR1)和信號轉導(IFNGR2)兩個亞單位組成的異源二聚體，IFNGR1和IFNGR2存在Val14Met和Gln64Arg氨基酸多態性，并發現它們的基因型與某些疾病(主要為傳染性、免疫學疾病)的易感性有關，但目前研究僅限于IFN-γ與AS的相關性研究，IFN-γ多態性及其受體基因多態性與AS及其斑塊穩定性研究甚少，本研究旨在明確本地區特定人群血IFN-γ水平及IFNGR多態性與AS斑塊穩定性間是否存在相互關系。經檢測，研究并沒有發現血漿IFN-γ水平及IFNGR多態性位點與AS斑塊穩定性有相互關系，血漿IFN-γ及IFNGR基因多態性尚不能作為云南漢族人群AS易損斑塊的預警指標。

[1]Gattoni A,Parlato A,Vangieri B,et al Interferon-gamma:biologic functions and HCV therapy(type Ⅰ/Ⅱ)[J].Clin Ter，2006,157(4):377-386.

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[3]Getz GS.Thematic review series:the immune system and atherogenesis[J].J Lipid Res,2005,46(1):1-10.

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Correlation between IFNGR gene polymorphism and atherosclerotic plaque stability in Yunnan Han nationality

YangTianrui1，SaYalian2

(1.DepartmentofGeriatrics;2.BasicResearchRoom,YunnanProvincialFirstPeople′sHospital,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective to explore the correlation between interferon-γ receptor(IFNGR)2 amino acid sites Val14Met and GIn64Arg polymorphism and atherosclerosis plaque stability in Yunnan Han nationality.Methods The patients with unstable atherosclerotic plaque in our hospital from March 2014 to March 2015 were collected as the observation group and contemporaneous patients with stable atherosclerotic plaque/ non- plaque as the control group.The peripheral venous blood was collected for extracting genomic DNA.IFNGR Val14Met and GIn64Arg loci genotype was detected by the PCR product direct sequencing method.The sequencing results were analyzed by adopting the DNAStar and GeneTool software.The levels of plasma cytokines(IFN-γ)was detected by the flow cytometry.Results Two hundreds and four native Han patients were included in this study,including the observation group,109 cases,age(76.89±12.08)years old;the control group,95 cases,age(65.99±16.32)years old.The polymorphism change of IFNGR1 Vall4Met loci was not found in the two groups.In the observation group,the frequency of IFNGR2 Gln64Arg genotype AA was 51.95%(40/77)，which of AG was 53.06%(52/98)and which of GG was 58.62%(17/29);in the control group,the frequencies were 48.05%(37/77),46.94%(46/98)and 41.38%(12/29),chi-square test,P=0.824.The IFNGR2 Gln64Arg genotypes AA,AG and GG had no relation with atherosclerotic plaque stability.The A and G allele frequencies in the observation group were 52.38%(132/252)and 55.13%(86/156)respectively,which of the control group were 47.62%(120/252)and 44.87%(70/156),chi-square test′sP=0.661.The IFNGR2 Gln64Arg A/G allele had no relation with atherosclerotic plaque stability.By Hardy-Weinberg genetic balance test,the gene frequency in this sample population was in accordance with the genetic equilibrium law.The plasma IFN-γ level in the observation group was(4.60±1.91)ng/mL,which in the control group was(4.88±2.10)ng/mL,the difference was not statistically significant(P=0.318);the plasma IFN-γ content had no relation with atherosclerotic plaque stability(P=0.308).Conclusion The genetic polymorphisms of IFNGR can not serve as a warning indicator of atherosclerotic plaque stability.

atherosclerosis;IFNGR;gene;polymorphism

楊天睿(1972-),碩士，主治醫師，主要從事老年病及心血管內科的研究。

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.011

R543.5

A

1671-8348(2016)33-4643-03

2016-03-11

2016-06-25)