卵巢癌不易發生腦轉移的機制探討*

杜 琴，鄭 藝，雷開鍵，賈鈺銘

(1.山西省大同市第三人民醫院腫瘤科 037006；2.遵義醫學院附屬醫院產科，貴州遵義 563000；3.四川省宜賓市第二人民醫院腫瘤科 644000)

?

卵巢癌不易發生腦轉移的機制探討*

杜 琴1，鄭 藝2，雷開鍵3△，賈鈺銘3

(1.山西省大同市第三人民醫院腫瘤科 037006；2.遵義醫學院附屬醫院產科，貴州遵義 563000；3.四川省宜賓市第二人民醫院腫瘤科 644000)

目的 分析卵巢癌明顯腦轉移少見的可能機制。方法 將肺腺癌A549細胞株和卵巢癌Skov3細胞株分別通過尾靜脈、腹腔、頸總動脈、顱內途徑注入雌性裸鼠體內(每個途徑16只裸鼠)：4～6周后處死裸鼠，取其腦、肺、腎、脾臟、肝臟、輸卵管、卵巢及腹腔腫瘤包塊，進行HE染色，分析腦內成瘤情況。結果 尾靜脈注射途徑 Skov3細胞株組無腦轉移， A549細胞株組有2例腦轉移；腹腔注射途徑 Skov3細胞株組無腦轉移， A549細胞株組有2例腦轉移；頸總動脈注射途徑 Skov3細胞株組未發現腦內成瘤，A549細胞株組8例腦內成瘤。以上3種顱外注射途徑，Skov3細胞株與A549細胞株在顱內成瘤率比較，差異有統計學意義(P<0.01)。而直接顱內注入途徑 Skov3細胞株組14例腦內成瘤，A549細胞株組10例腦內成瘤，二者比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論 血腦屏障可能在阻止卵巢癌腦轉移過程中起了重要作用。

卵巢腫瘤；肺腫瘤；腦轉移；裸鼠；血腦屏障

卵巢癌是女性生殖系統惡性腫瘤之一，5年存活率低，約25%～30%。卵巢癌容易在腹腔廣泛播散，70%的病例就診時已屬晚期。但卵巢癌極少發生腦轉移，尤其是上皮細胞性卵巢癌，據相關報道卵巢癌腦轉移的發生率為0.29%～0.80%[1-4]。而肺癌腦轉移很常見，約20%～50%，在腦轉移瘤中來源于肺癌的占18%～64%[5]。為了探索卵巢癌腦轉移少見的原因，筆者將卵巢癌Skov3細胞株和肺腺癌A549細胞株通過不同途徑注入裸鼠體內，觀察這兩種細胞株在顱內成瘤的差異，從而探討卵巢癌不易發生腦轉移的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雌性BALB/C裸鼠， 6～8 周齡，體質量(18±2)g，無特定病原體級(SPF)，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養于SPF動物房。肺腺癌A549細胞株及卵巢癌Skov3細胞株，購自北京金紫晶生物醫藥技術有限公司。

1.2 主要試劑 RPMI1640培養液、滅活新生牛血清、胰酶購自Hycone生物制品公司；PBS液購自貴陽愛瑞生物有限公司；氯化鈉購自上海試劑總廠；水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司；甲醛溶液購自重慶市北碚精細化工廠。

1.3 主要儀器 SHZ-88A往復式水浴恒溫振蕩器購自江蘇太倉市實驗設備廠；Centrifuge5415D離心機購自德國Eppendorf公司；低溫冰箱MDF-38ZE購自Sanyo公司；Nikon光學顯微鏡購自尼康儀器有限公司；BP211D精密電子天平購自北京賽多利斯電子有限公司；CO2孵箱購自Thermo Scientific公司；TMS-1015倒置顯微鏡購自Olympus公司。

1.4 細胞培養及制備 肺腺癌A549細胞株及卵巢癌Skov3細胞株用RPMI1640培養液培養(含10%新生牛血清)，當細胞達到80%～90%融合時進行消化。最后以0.9%氯化鈉注射液稀釋至細胞密度為1×107/mL和3×107/mL兩種單細胞懸液，備用。

1.5 接種方法 接種動物按以下途徑分別接種肺腺癌A549細胞株和卵巢癌Skov3細胞株，每種細胞每個途徑各接種16只裸鼠。(1)尾靜脈途徑：裸鼠尾部皮膚用75%乙醇常規消毒，將制備好的0.15 mL腫瘤細胞懸液(濃度為1×107/mL)注入裸鼠尾靜脈，共注入1.5×106個腫瘤細胞。(2)腹腔途徑：裸鼠腹部皮膚用聚維酮碘消毒，將制備好的0.15 mL腫瘤細胞懸液(濃度為1×107/mL)注入裸鼠左側腹腔。(3)頸總動脈途徑：用2%水合氯醛(麻醉劑量標準：200 mL/kg)腹腔注射麻醉裸鼠(麻醉后觀察裸鼠呼吸、心率穩定，無大小便失禁)，以仰臥位將已麻醉的裸鼠固定于實驗木板上，用聚維酮碘消毒裸鼠頸部皮膚，剪開皮膚，鈍性逐層分離皮下組織，暴露右側頸總動脈，用0號絲線標記頸總動脈近心端并結扎，遠心端用動脈夾(3 mm型號)夾閉，用眼科剪刀在兩端封閉的這一段頸總動脈動脈壁剪開一個小斜口，再用PE導管插入頸總動脈斜口，取掉遠心端動脈夾，繼續插入1 cm，沿導管注入0.05 mL腫瘤細胞懸液(濃度為3×107/mL)，用0#絲線將注射處遠端結扎，以防細胞回漏。聚維酮碘常規消毒手術切口后立即縫合皮膚。術后裸鼠保溫，待裸鼠蘇醒后放入籠中繼續飼養。(4)顱內途徑：裸鼠麻醉同上，俯臥位固定于實驗木板上，參照Kastritis 等[6]的方法進行顱內注射：用聚維酮碘消毒裸鼠頭部皮膚，在裸鼠頭頂部正中切開長約0.5 cm皮膚，暴露顱骨，在前囟前0.5 mm、中線右側2.0 mm處為進針點。用1 mL注射器抽吸3×107/mL的單細胞懸液0.05 mL(含有1.5×106個腫瘤細胞)，用適當力度注入顱內，進針深度約為3 mm，消毒棉球壓迫止血數分鐘，縫合切口。術后裸鼠保溫，待裸鼠蘇醒后放入籠中繼續飼養。有研究報道[7-8]。將NCI-H460細胞接種在裸鼠肺葉中，4周后發現腦轉移、骨轉移及腎上腺轉移。本實驗繼續飼養裸鼠4～6周后，部分裸鼠行動遲緩，進食減少，出現呼吸急促，消瘦，腹部增大，腹部可捫及包塊。用頸椎脫臼法處死裸鼠，系統解剖探查，取腦、肺、腎臟、脾臟、肝臟、雙側輸卵管、卵巢及腹腔腫瘤包塊，10%中性甲醛固定，石蠟包埋， HE染色。所有病理切片均由同一位具有高級職稱的病理專家閱片確認。

1.6 統計學處理 采用SPSS16.0統計軟件進行統計分析。計數資料用率或構成比表示，各率或構成比的比較用χ2檢驗；因為n<40，T<1，用四格表的Fisher確切概率法統計，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 尾靜途徑成瘤或轉移情況 見表1，兩種細胞株顱內轉移比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 裸鼠尾靜脈注射Skov3細胞和A549細胞腦轉移比較(n)

2.2 腹腔注射途徑成瘤或轉移情況 腹腔腫瘤大體外觀呈球形，直徑約1 mm至2 cm大小不等，白色，質硬，表面凹凸不平，與腹壁及腹腔周圍器官有粘連，將腫瘤切開后，內部實質色白，無液腔及壞死區域。肺臟、膈肌、肝臟、胰臟、胃、脾臟、卵巢、輸卵管、子宮等表面均可見到結節。其成瘤或轉移情況見表2，兩種細胞株顱內轉移比較差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 裸鼠腹腔注射Skov3細胞和A549細胞腦轉移比較(n)

2.3 右頸總動脈注射途徑 由于右側總動脈被結扎，個別裸鼠出現同一方向轉圈運動及一側眼瞼閉合現象，可能是因為右側大腦缺血及損傷右側迷走神經引起。成瘤或轉移情況，見表3，兩種細胞株顱內轉移比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 裸鼠頸總動脈注射Skov3細胞和A549細胞腦轉移比較(n)

2.4 前3種途徑裸鼠顱內轉移總體情況 見表4，兩種細胞株顱內轉移比較差異有統計學意義(χ2=19.200，P<0.01)。

表4 前3種途徑注射Skov3細胞和A549細胞腦轉移總體比較(n)

2.5 裸鼠顱內直接注射途徑 Skov3細胞和A549細胞腦內成瘤率都很高，差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 裸鼠顱內注射Skov3細胞和A549細胞腦內成瘤情況比較(n)

3 討 論

卵巢癌起病隱匿，腹腔內轉移率高，復發率高，預后差，在女性生殖系統惡性腫瘤中的病死率居高位[9]。但上皮性卵巢癌發生腦轉移的極少見[10]，而非小細胞肺癌腦轉移很常見。筆者假設卵巢癌Skov3細胞株在裸鼠體內會和在人體內一樣，腦轉移也很少。為此，通過不同途徑將這兩種細胞株注入裸鼠體內，或許對探索卵巢癌不易腦轉移的機制有一定啟示。從動物實驗結果分析，尾靜脈注射途徑、腹腔注射途徑、頸總動脈注射途徑都在裸鼠體內不同部位形成一定的腫瘤灶，雖然Skov3細胞株形成腫瘤灶的比率相對較少，但卵巢癌Skov3細胞株未發現1例在腦內成瘤，這應該不是偶然現象。筆者可以據此推斷，血腦屏障在阻擋卵巢癌Skov3細胞進入腦組織的過程中起了重要作用。而直接注入腦組織的兩種腫瘤細胞成瘤率都很高，說明裸鼠腦組織環境并不能抑制肺癌A549細胞和卵巢癌Skov3細胞的生長。裸鼠頸總動脈注射途徑，卵巢癌Skov3細胞株未發現顱內成瘤，而肺腺癌A549細胞株顱內成瘤率達到50%，這一點與臨床肺癌易發生腦轉移相符，而卵巢癌細胞為什么不容易通過血腦屏障，目前還不清楚。尾靜脈注射途徑與腹腔注射途徑顱內轉移差異無統計學意義，可能是樣本量不夠；同時也提示，采用這兩種途徑循環腫瘤細胞數量不是那么多，因而肺癌細胞株進入大腦的可能性也低。

血腦屏障是機體最重要的內部屏障之一，由腦毛細血管內皮細胞、基膜和膠質細胞足突共同組成[11]。血腦屏障的結構包括：毛細血管內皮細胞之間的緊密連接、毛細血管基膜、由星形膠質細胞終足圍繞形成的毛細血管基膜外的膠質膜[12]。血腦屏障是維持腦內環境穩定的重要結構，它允許腦組織所需要的營養物質通過的同時而可有效阻擋有害物質的侵入[13]。由于腦毛細血管內皮的屏障功能，蛋白質、大分子藥物以及各種染料不易透過血腦屏障；腦毛細血管內皮細胞間的緊密接合含有帶負電荷的膠質，故帶負電荷的物質不易通過血腦屏障[14]。是否卵巢癌Skov3細胞株整體帶負電荷的分子多，從而被血腦屏障排斥在外，是筆者下一步研究的方向。腹腔注射途徑，卵巢癌Skov3細胞株未發現肺內轉移，可能是由于腹膜屏障也會在一定程度上阻擋Skov3細胞向腹腔外侵犯。

綜上所述，一旦血腦屏障在某些因素影響下被破壞，卵巢癌腦轉移的概率則大大增加。卵巢癌患者保持血腦屏障的完整性，對于減少卵巢癌腦轉移起到非常重要的作用。至于卵巢癌細胞不容易通過血腦屏障,是其電荷屏障作用還是相關分子作用，有待于今后進一步探討。

[1]Mayer RJ,Berkow IR,Griffiths CT.Central nervous system involvement by ovarian carcinoma[J].Cancer,1978,41(2):776-783.

[2]Larson DM,Copeland LJ,Moser RP,et al.Central nervous system metastases in epinthelial ovarian carcinoma[J].Obstet Gynecol,1986,68(6):746-750.

[3]Ross WM,Carmichael JA,Shelley WE.Advanced carcinoma of the ovary with central nervous system relapse[J].Gynecol Oncol,1988,30(3):398-406.

[4]Hardy JR,Harvey VJ.Cerebral metastases in patients with ovarian cancer treated with chemotherapy[J].Gynecol Oncol,1989,33(3):296-300.

[5]Tasdemiroglu E,Kaya AH,Bek S,et al.Neurologic complications of cancer.part1:Central Nervous System Metastasis[J].Neurosurg Q,2004,14(2):71.

[6]Kastritis E,Efstathiou E,Gika D,et al.Brain metastases as isolated site of relapse in patients with epithelial ovarian cancer previously treated with platinum and paclitaxel-based chemotherapy[J].Int J Gynecol Cancer,2006,16(3):994-999.

[7]李如軍，刁藝，黃強，等．可移植性人腦膠質瘤組織裸小鼠腦內移植及其MR顯像研究[J]．癌癥，2007，26(9)：937-941．

[8]Johnston MR,Mullen JB,Pagura ME,et al.Validation of an orthotopic model of human lung cancer with regional and systemic metastases[J].Ann Thorac Surg,2001,71(4):1120-1125.

[9]Howard RB,Mullen JB,Pagura ME,et al.Characterization of a highly metastatic,orthotopic lung cancer model in the nude rat[J].Clin Exp Metastasis,1999,17(2):157-162.

[10]Cho KR.Ovarian cancer update:lessons from morphology,molecules,and mice[J].Arch Pathol Lab Med,2009,133(11):1775-1781.

[11]張蓉，劉麗影卵巢上皮細胞癌腦轉移3例報道及文獻復習[J].醫學科研通訊，1994,23(1):28.

[12]成令忠．組織學與胚胎學[M]．4版．北京：人民衛生出版社，1996：101-105．

[13]吳旭東，曹小定．血腦屏障與腦缺血[J]．國外腦血管病雜志，2000，8(5)：272-275．

[14]桑潔，劉萍，趙寶全．血腦屏障分子組成研究進展[J]．國際藥學研究雜志，2011，38(3)：201-205．

Investigation on mechanism of ovarian cancer scarcely developing brain metastasis*

DuQin1，ZhengYi2，LeiKaijian3△，JiaYuming3

(1.DepartmentofOncology，DatongMunicipalThirdPeople′sHospital,Datong,Shanxi037008,China； 2．DepartmentofObstetrics,AffiliatedHospital,ZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563000,China; 3.DepartmentofOncology,YibinMunicipalSecondPeople′sHospital,Yibin,Sichuan644000,China)

Objective To observe the intracranial tumorigenicity situation of lung cancer cell strain and ovarian cell strain by injecting them into the female nude mice with different approaches and to analyze the possible mechanism for scarce brain metastasis of ovarian cancer to provide a certain thinking for the treatment of brain metastasis of lung cancer.Methods Ovarian cancer cell strain Skov3 and lung cancer cell strain A549 were injected into female nude mice respectively through tail veins, abdominal cavity, common carotid artery and brain tissue. There were 16 nude mice in each approach. All the nude mice were killed 4-6 weeks later. Then the brain, lungs, kidneys, spleen, liver, fallopian tube, ovary and abdominal tumor mass were taken by HE staining for observing the cerebral tumorigenicity situation.Results By the caudal vein injection, there was no brain metastasis in the Skov3 strain group, while in the A549 strain group，2 cases of brain metastasis occurred. By the aabdominal cavity injection, there was no brain metastasis in the Skov3 strain group, but 2 cases of brain metastasis occurred in the A549 strain group. By the common carotid artery injection, there was no brain metastasis in the Skov3 strain group, but 8 cases of brain metastases occurred in the A549 group. The intracranial tumorigenicity of Skov3 strain and A549 strain had statistical difference among these 3 kinds of extracranial injection approaches(P<0.01). By intracranial direct injection approach, 14 cases of brain tumorigenicity occurred in the Skov3 strain group, while 10 cases of brain tumorigenicity occurred in the A549 strain group, the difference had no statistical difference. Conclusion Blood brain barrier maybe plays an important role in preventing ovarian cancer cells from metastasizing into brain.

ovarian neoplasms；lung neoplasms；brain metastasis；nude mice；blood brain barrier

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.004

四川省衛生廳科技基金資助項目(120014)；四川省宜賓市科技基金資助項目(2012ZSF007)。 作者簡介：杜琴(1984-)，碩士，住院醫師，從事腫瘤轉移的研究。△

R737.31

A

1671-8348(2016)33-4619-03

2016-02-18

2016-06-06)