載脂蛋白J對缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞損傷的影響*

李利娟，馬彥卓，孔令鋒，陳 瑜，王冬梅△

(1.河北北方學院研究生部，河北張家口 075000；2.白求恩國際和平醫院心內科,石家莊 050000)

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載脂蛋白J對缺氧/復氧誘導的乳鼠心肌細胞損傷的影響*

李利娟1，2，馬彥卓2，孔令鋒2，陳 瑜2，王冬梅2△

(1.河北北方學院研究生部，河北張家口 075000；2.白求恩國際和平醫院心內科,石家莊 050000)

目的 觀察載脂蛋白J(ApoJ)對缺氧/復氧(H/R)誘導的乳鼠心室肌細胞損傷的影響及其相關的信號傳導通路。方法 用攜帶ApoJ基因的重組腺病毒感染乳鼠心肌細胞使ApoJ高表達。利用三氣培養箱建立H/R模型，SOD類似物Mn(Ⅲ)TBAP和真核細胞翻譯起始因子2α(eIF2α)去磷酸化抑制劑Salubrinal提前預處理，將心肌細胞分成對照組、H/R組、ApoJ組、ApoJ+H/R組、Mn(Ⅲ)TBAP+H/R組、Salubrinal+H/R組。利用MTT法檢測細胞的存活率；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定細胞乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量、凋亡蛋白酶半胱天冬酶-3/7(caspase-3/7)及細胞內超氧化物歧化酶(SOD)活性；Western blot檢測ApoJ、氧化酶Nox2/gp91phox、內質網特異性凋亡蛋白caspase-12、CHOP的表達及eIF2α的磷酸化水平。結果 ApoJ 基因重組腺病毒轉染后，心肌細胞ApoJ蛋白高表達。與對照組相比，H/R組細胞存活率和SOD的活性明顯下降，LDH的漏出量及caspase-3/7的活性升高，Nox2/gp91phox、caspase-12、CHOP蛋白的表達明顯升高，eIF2α的磷酸化水平升高。與H/R組相比，ApoJ組、Mn(Ⅲ)TBAP組及Salubirnal組LDH的漏出量及caspase-3/7的活性明顯降低,ApoJ高表達使細胞存活率和SOD的活性顯著升高，Nox2/gp91phox、caspase-12、CHOP蛋白的表達明顯下降，而eIF2α的磷酸化水平顯著升高。結論 ApoJ通過抗氧化應激及內質網應激的作用，減輕H/R誘導的心肌細胞損傷。

載脂蛋白J；缺氧/復氧；內質網應激；氧化應激；細胞凋亡

心肌缺血/再灌注(MI/R)損傷是心肌組織缺血一段時間后再恢復血流，反而使心肌細胞損傷加重，表現為再灌注后缺血的心肌出現舒縮功能降低、心律失常、心肌能量代謝障礙、超微結構的變化和血管無復流等現象。心肌細胞凋亡是MI/R損傷心肌細胞死亡的主要方式之一。載脂蛋白J(Apolipoprotein-J,ApoJ)又被稱為凝集素，是一種新型多功能分泌型糖蛋白，廣泛存在于人體大部分組織與體液中[1]。該蛋白參與多種不同的病理生理過程，如膜的再利用、精子成熟、補體防御、脂質運輸、抗炎、抗細胞凋亡、組織分化和重構、神經退行性變和腫瘤的形成等[2-3]。ApoJ是急性期反應蛋白，正常生理狀態下表達量很少，但在應激的病理狀態下表達增多，如急性心肌梗死、動脈粥樣硬化、心肌炎和氧化應激等。研究表明當心臟受到損傷時，ApoJ通過高表達發揮抗凋亡的作用[4]。Jun等[5]發現ApoJ通過Akt和GSK-3β的激活保護H9C2心肌細胞對抗由過氧化氫誘導的凋亡。本課題組前期研究發現ApoJ通過高表達對抗由血管緊張素Ⅱ誘導的細胞凋亡[6]，但目前針對ApoJ對H/R誘發的心肌細胞損傷影響的研究較少見。本研究通過建立離體乳鼠心肌細胞H/R損傷模型模擬MI/R，觀察ApoJ對MI/R誘導的乳鼠心肌細胞損傷的影響及其相關的信號傳導通路。

1 材料與方法

1.1 材料 SD大鼠，雌雄不拘，1～3 d齡，由河北醫科大學實驗動物中心提供。攜帶ApoJ基因的重組腺病毒購自Invitrogen；ApoJ抗體購自EterLife,Birmingham；CHOP、caspase-12、Nox2/gp91phox抗體購自ABcam；eIF2α、p-eIF2α購自Cell Signaling Technology；GAPDH、tublin抗體購自Sigma；LDH、SOD、caspase-3/7活性測定試劑盒購自Promega公司；PVDF 膜購自Santa Cruz；增強型ECL發光液購自Vazyme；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原蛋白酶、高糖DMEM培養基、新生胎牛血清(FBS)購自Gibco；MTT、二甲基亞砜(DMSO)、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)、過硫酸銨(APS)、Tween-20、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)均購自美國Sigma公司；RIPA裂解液、PMSF及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所；其余化學試劑為國產分析純產品。

1.2 原代心肌細胞培養 參照文獻[7]的方法并結合實際改進。在無菌條件下用眼科剪取出心臟置于預先盛有AD液的無菌平皿內。去除心房和大血管，剪成1 mm×1 mm×1 mm左右大小的碎塊，加入含有0.06%胰酶和0.025%的Ⅱ型膠原酶的AD液中，37 ℃水浴振蕩箱反復消化直至組織塊完全消化為止。將含有血清的細胞離心(1 500 r/min,5 min)后棄上清液，加入適量的完全培養液(含高糖DMEM，10%的胎牛血清，1%青鏈霉素)重懸心肌細胞，接種至100 cm2培養皿。37℃，5%CO2培養箱培養1.5 h以純化心肌細胞(差速貼壁法)，然后平均接種于60 cm2的培養皿中。調整細胞密度后，按5×105/mL接種至24孔板，每組6孔，共6個復組，4×104/mL接種至96孔板，每組6孔，共6個復組。

1.3 Apo J的轉染 去除完全培養液，用高糖DMEM沖洗細胞2次，以1∶200的濃度將攜帶ApoJ基因的腺病毒加入高糖DMEM(加病毒時關風機)混勻，ApoJ轉染組加入適量腺病毒和高糖DMEM的混勻液，未攜帶ApoJ基因的腺病毒作為對照組。37℃ 5%CO2培養箱培養4～6 h后更換為完全培養液，轉染36～48 h后提取細胞蛋白進行Western blot檢測。

1.4 心肌細胞缺氧/復氧模型的建立及分組 用純氮(N2)以1 L/min的流速充分飽和不含胎牛血清的DMEM培養基，30 min后換液并置于缺氧培養箱中，同樣以1 L/min的流速通入含95%N2和5%CO2的混合氣體，缺氧培養4 h后更換正常培養基放回正常含95%空氣和5%CO2培養箱中復氧培養12 h，構建乳鼠原代心肌細胞缺氧/復氧模型。實驗分組：對照組(在正常含95%空氣和5%CO237 ℃培養箱中培養)、H/R組(按上述操作給予缺氧/復氧處理)、ApoJ組(用攜帶ApoJ基因的重組腺病毒感染乳鼠心肌細胞使ApoJ高表達，在正常含95%空氣和5%CO237℃培養箱中培養)、ApoJ+H/R組(用攜帶ApoJ基因的重組腺病毒感染乳鼠心肌細胞使ApoJ高表達，然后給予缺氧/復氧處理),Mn(Ⅲ)TBAP+H/R組[Mn(Ⅲ)TBAP提前預處理1 h后再給予缺氧/復氧干預]，Salubrinal+H/R組(Salubrinal提前預處理1 h后再給予缺氧/復氧干預)。

1.5 MTT檢測細胞的存活率 取生長狀態良好的乳鼠原代心肌細胞接種于96孔板中，并按照分組分別處理各組細胞，培養結束后在各孔加入20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，在搖床上作用1 min，搖勻，在37 ℃下繼續正常培養4 h后，棄上清液后各孔加入150 μL的DMSO，加樣器吹打均勻(勿出氣泡)后在酶標儀上檢測570 nm處各孔的吸光度值，每組設置6個復孔。

1.6 ELISA法測定細胞中乳酸脫氫酶(LDH)的漏出量、細胞內超氧化物歧化酶(SOD)活性及caspase-3/7的活性 取生長狀態良好的乳鼠原代心肌細胞接種于24孔板中，并按照分組分別處理各組細胞，培養結束后收集各組細胞上清液，3 000 r/min離心15 min，取上清液，按照檢測試劑盒的說明步驟，檢測各組心肌細胞上清液中LDH的分泌量。同時用PBS沖洗貼壁的細胞2遍，加入胰酶(0.25%)消化3～5 min，顯微鏡下觀察消化程度，加入完全培養液終止消化，將上述液體1 500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS清洗1遍后用少量的PBS重懸細胞，利用超聲裂解細胞膜(40～60 W，30 s，間隔10 s，重復2次)，顯微鏡下觀察細胞已裂解，5 000 r/min離心15 min后取上清液，按照檢測試劑盒的說明步驟，檢測各組心肌細胞內SOD、caspase-3/7的活性。

1.7 Western blot法檢測ApoJ、CHOP、caspase-12、Nox2/gp91phox、eIF2α、p-eIF2α蛋白表達 分別取各組心肌細胞，提取蛋白，用BCA法測定各組樣本蛋白質濃度，樣本經凝膠電泳、轉膜、封閉、加入一抗(ApoJ、CHOP、caspase-12、Nox2/gp91phox、eIF2α、p-eIF2α)和二抗，用GBOX成像，灰度值用Image J軟件分析。

2 結 果

2.1 ApoJ對細胞存活率、細胞損傷及凋亡的影響 用攜帶ApoJ基因的腺病毒感染乳鼠心肌細胞，ApoJ的表達明顯升高，見圖1A，表明ApoJ高表達模型建立成功。與對照組相比，H/R損傷后心肌細胞存活率明顯下降；與H/R組對比，ApoJ高表達可使心肌細胞存活率明顯升高(P<0.05)，見圖1B。與對照組相比，H/R損傷后，心肌細胞上清液LDH的漏出量及caspase-3/7的活性顯著升高(P<0.05)；與H/R組對比，ApoJ高表達、Mn(Ⅲ)TBAP 和Salubirnal可使細胞上清液LDH的漏出量及caspase-3/7的活性明顯下降(P<0.05)，見圖1C和1D。

2.2 ApoJ通過PERK-eIF2α通路抑制H/R損傷誘導的內質網應激 與對照組相比較，H/R損傷后心肌細胞內質網應激相關凋亡蛋白caspase-12和CHOP的表達明顯升高(P<0.05)，高表達ApoJ后，與H/R組對比，ApoJ+H/R組心肌細胞凋亡蛋白caspase-12和CHOP的表達顯著下降(P<0.05)見圖2A和2B。與對照組相比較，H/R損傷后心肌細胞eIF2α的磷酸化水平升高(P<0.05)，高表達ApoJ后，與H/R組對比，APOJ+H/R組心肌細胞eIF2α的磷酸化水平進一步升高(P<0.05)，見圖2C。

2.3 ApoJ抑制H/R誘導的氧化應激 與對照組相比較，H/R損傷后心肌細胞SOD的活性明顯下降，Nox2/gp91phox的表達明顯升高(P<0.05)，ApoJ高表達后，與H/R組對比，ApoJ+H/R組心肌細胞SOD的活性明顯升高，Nox2/gp91phox的表達明顯下降(P<0.05)，見圖3。

A:通過Western blot的方法觀察ApoJ重組腺病毒感染的心肌細胞ApoJ的表達。B:通過MTT檢測細胞的活力。C:通過檢測培養液中心肌細胞LDH的漏出量來確定心肌細胞的損傷程度。D:通過檢測caspase-3/7的活性明確H/R誘導的心肌細胞凋亡。**:P<0.05，與對照組比較,##:P<0.05,與H/R組比較；1：對照組；2：Apo J組；3：H/R組；4：Apo J+H/R組；5：Mn(Ⅲ)TBAP+H/R組；6：SaJubriani+H/R組。

圖1 高表達ApoJ減輕H/R誘導的心肌細胞損傷

A、B:Western blot檢測caspase-12和CHOP的表達。C:Western blot檢測eIF2α的磷酸化水平。**:P<0.05，與對照組比較；##:P<0.05，與H/R組比較。

圖2 ApoJ通過PERK-eIF2α通路抑制H/R損傷誘導的內質網應激

A:Western blot檢測心肌細胞Nox2/gp91phox蛋白的表達。B:通過SOD試劑盒檢測心肌細胞SOD的活性。**:P<0.05 與對照組比較,##:P<0.05 與H/R組比較。

圖3 ApoJ抑制H/R誘導的氧化應激

3 討 論

目前急性心肌梗死仍是全世界死亡和致殘的主要原因之一。盡早開通梗死相關血管，恢復血流可以減少梗死面積、改善臨床結果。然而，無論是溶栓或經皮冠狀動脈成形術(PCI)治療，MI/R損傷都是無法回避的問題及難以克服的治療難點，因此如何減輕MI/R損傷一直是研究熱點。

給予缺氧/復氧處理后心肌細胞的存活率明顯下降，LDH的漏出量明顯升高，表明H/R模型構建成功。ApoJ 基因重組腺病毒轉染組ApoJ蛋白的表達明顯升高，表明ApoJ高表達模型構建成功。心肌細胞LDH漏出量變化是反映心肌壞死的重要指標。caspase是細胞死亡的關鍵性中介，而caspase-3是公認的細胞凋亡執行者。本試驗測定了心肌細胞的存活率、LDH的漏出量和caspase-3/7的活性，結果顯示H/R損傷導致心肌細胞的存活率明顯下降，LDH漏出量和caspase-3/7活性升高，ApoJ高表達可顯著升高心肌細胞的存活率，降低LDH漏出量和caspase-3/7活性。表明ApoJ可減輕H/R誘導的心肌細胞損傷。

既往研究表明，心肌缺血再灌注損傷可促進活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)過度生成，產生強烈的氧化應激，進一步加重心臟病及其并發癥的發生、發展[8-9]。在I/R心肌中NADPH氧化酶是最重要的超氧化物酶，Nox2/gp91phox是NADPH氧化酶的關鍵組成部分。SOD是機體內抗氧化系統的重要組成部分，通過清除自由基而發揮細胞保護作用,SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。Jun等[5]研究表明ApoJ能減輕I/R損傷誘導的氧化應激。本研究發現H/R損傷使Nox2/gp91phox的表達明顯增高，SOD活性顯著下降，而ApoJ高表達可顯著降低Nox2/gp91phox的表達，使心肌細胞SOD活性增加。以上結果表明，ApoJ可減少超氧化物的過量產生，減輕H/R損傷誘導的氧化應激。

內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是細胞的內源性自我保護性機制，有利于恢復細胞內環境穩態和維持生存，但過強的或長時間的ERS 反應可以引起細胞的凋亡[10]。既往研究已證實，由H/R損傷誘導的過度ERS可通過下游的凋亡信號分子CHOP、caspase-12或JNK途徑激活凋亡機制，進而激活下游的caspase-3等引起細胞凋亡，甚至導致細胞死亡，且caspase-12是內質網應激凋亡通路的特異性蛋白[11-14]。本研究發現H/R損傷導致心肌細胞caspase-12、CHOP的表達明顯升高，而ApoJ高表達可降低caspase-12、CHOP的表達，表明ApoJ可通過減輕內質網應激來減少MI/R損傷誘導的細胞凋亡。H/R損傷后，內質網應激通過誘導未折疊蛋白反應(UPR)試圖恢復細胞穩態保護細胞，PERK途徑是UPR保護性機制中重要的信號通路。PERK通路激活后，真核細胞翻譯起始因子2α(eIF2α)發生磷酸化，使細胞內的大多數mRNA的翻譯下降，增強內質網對蛋白的折疊功能，阻止錯誤折疊或未折疊蛋白的進一步聚集，促進內質網穩態的恢復[15-16]。Zhu等[17]研究表明eIF2α的磷酸化水平升高可使大腦缺氧/復氧造成的運動神經元損傷降至最低。本實驗結果證實H/R損傷后eIF2α的磷酸化水平升高以減少未折疊蛋白及錯誤蛋白的合成，ApoJ高表達后eIF2α的磷酸化水平進一步升高使此保護作用增強，提示ApoJ是通過PERK/ eIF2α通路來減輕心肌細胞內質網應激反應。

Salubrinal是一種由細胞合成的，誘導eIF2α磷酸化和抑制其去磷酸化的選擇性抑制物，能通過抑制eIF-2α去磷酸化和JNK磷酸化，減輕ERS和細胞凋亡。Mn(Ⅲ)TBAP是SOD的類似物、ROS的清道夫，可通過減少ROS而減輕內質網應激。本研究發現，H/R損傷導致LDH漏出量和caspase-3/7活性明顯升高，ApoJ高表達、Mn(Ⅲ)TBAP、Salubrinal可顯著降低心肌細胞LDH的漏出量和caspase-3/7活性。表明抑制H/R損傷誘導的氧化應激和內質網應激可減輕細胞損傷和凋亡。以上這些結果為ApoJ減輕H/R損傷誘導的心肌損傷提供了直接證據。

綜上所述，ApoJ通過抗氧化應激和抗內質網應激減輕H/R引起的心肌細胞損傷。

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Effect of apolipoprotein-J on hypoxia/reoxygenation induced myocardial cells injury in neonatal rat*

LiLijuan1,2，MaYanzhuo2，KongLingfeng2，ChenYu2，WangDongmei2△

(1.DepartmentofPostgraduates，HebeiNorthUniversity，Zhangjiakou，Hebei075000,China； 2.DepartmentofCardiology，BethuneInternationalPeaceHospital，Shijiazhuang，Hebei050000，China)

Objective To evaluate the effects of apolipoprotein-J(ApoJ)on hypoxia/reoxygenation(H/R)induced neonatal rat ventricular cells(NRVCs)injury and its related signaling pathways. Methods ApoJ high expression was achieved by infection with recombinant adenovirus in NRVCs. The three gas incubator was used to establish H/R model，SOD mimetic Mn(Ⅲ)tetrakis(4-benzoic acid)porphyrin chloride and eIF2α dephosphory inhibitor Salubrinal were performed the pretreatment. The NRVCs were divided into four groups:normal control group, H/R, ApoJ group, ApoJ+H/R group, Mn(Ⅲ)TBAP+H/R group and Salubrinal+H/R group. The cell viability was measured by MTT assay; the leakages of LDH, the expression of SOD and caspase-3/7 activity were detected by ELISA. The protein expression levels of ApoJ, Nox2/gp91phox, caspase-12, CHOP, and the phosphorylation level of eukaryotic initiation factor 2α(eIF2α)were determined by Western blot. Results ApoJ protein in myocardial cells was highly expressed after infection by recombinant adenoviru. Compared with the control group, the cell viability and the activity of SOD were significantly decreased, the leakages of LDH and the activity of caspase-3/7 were increased in the H/R group, the protein expression level of Nox2/gp91phox,caspase-12 and CHOP and the phosphorylation level of eIF2α were increased. Compared with the H/R group, the leakages of LDH and the activity of caspase-3/7 in the ApoJ overexpression group, Mn(Ⅲ)TBAP group and Salubirnal group were significantly decreased. ApoJ overexpression significantly increased the cell viability and the activity of SOD. Moreover, the protein expression level of Nox2/gp91phox, caspase-12 and CHOP were significantly decreased, while the phosphorylation level of eIF2α was markedly increased.Conclusion ApoJ alleviates H/R induced myocardial cellular injury by anti- oxidative stress and endoplasmic reticulum stress.

ApoJ；hypoxia/reoxygenation；endoplasmic reticulum stress；oxidative stress；cell apoptosis

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.33.002

河北省應用基礎研究計劃重點基礎研究項目(13967710D)。 作者簡介：李利娟(1988-)，在讀碩士，主要從事心血管內科方面的研究。△

R331

A

1671-8348(2016)33-4612-04

2016-05-18

2016-07-13)