食管鱗狀細胞癌組織中血管內皮生長因子C、D的表達變化及意義

馬俊，魯建軍，繆蓉，巫國勇，羅紅鶴

(中山大學附屬第一醫院，廣州510080)

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食管鱗狀細胞癌組織中血管內皮生長因子C、D的表達變化及意義

馬俊，魯建軍，繆蓉，巫國勇，羅紅鶴

(中山大學附屬第一醫院，廣州510080)

目的 觀察食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織中血管內皮生長因子C(VEGF-C)、VEGF-D的表達變化，并探討二者與ESCC轉移、復發的關系。方法 收集60例ESCC患者的腫瘤組織及癌旁正常組織標本。用免疫組化法檢測組織中VEGF-C、VEGF-D陽性表達率及表達水平，計算ESCC組織微血管密度(MVD)、微淋巴管密度(MLVD)；分析VEGF-C、VEGF-D表達水平與ESCC患者臨床病理參數的關系；采用Spearman等級相關分析VEGF-C、VEGF-D表達水平與MVD、MLVD的關系；患者均行CE根治術，術后隨訪1年，觀察復發或轉移患者腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-D表達水平；采用Logistic回歸對ESCC淋巴結轉移的影響因素進行分析。結果 ESCC組織與癌旁正常組織中VEGF-C、VEGF-D的陽性表達率、相對表達量比較差異有統計學意義(P均<0.05)。VEGF-C、VEGF-D表達水平與ESCC淋巴結轉移、臨床分期有關(P均<0.05)，VEGF-C表達水平還與腫瘤浸潤深度有關(P均<0.05)。經Spearman等級相關分析發現，ESCC組織中VEGF-C表達水平與MLVD、MVD呈正相關(r分別為0.521、0.561，P均<0.05)；VEGF-D表達水平與MLVD呈正相關(r=0.660，P<0.05)。術后復發轉移患者ESCC組織VEGF-C、VEGF-D相對表達量高于術后無復發轉移患者(P均<0.05)。經Logistic回歸分析發現，VEGF-C、VEGF-D及腫瘤浸潤程度是ESCC患者淋巴結轉移的獨立危險因素(OR分別為8.321、7.683、0.104，P<0.05)。結論 ESCC組織中VEGF-C和VEGF-D呈高表達，二者與ESCC轉移、復發有關。

食管鱗狀細胞癌；血管內皮生長因子C；血管內皮生長因子D；微血管密度；微淋巴管密度

食管癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，男性發病率和病死率為女性的2～4倍[1]。我國是食管癌高發國家之一，以食管鱗狀細胞癌(ESCC)為主，約占食管癌總數的90%[2]。血管內皮生長因子(VEGF)是具有促血管內皮細胞有絲分裂活性的一種糖基化堿性蛋白。VEGF家族共有7個成員：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盤生長因子，均為同源二聚體糖蛋白，具有相似的空間結構，在新生血管生成和淋巴管生成等方面有重要的調節作用[3]。目前研究認為，VEGF-C、VEGF-D對促進腫瘤組織中新生血管形成及淋巴管生成起重要作用[4，5]，然而其具體作用機制尚未完全清楚。本研究觀察ESCC組織VEGF-C、VEGF-D的表達變化，并探討二者與ESCC轉移、復發的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年6月～2013年9月本院收治的ESCC患者60例，均經病理檢查確診，均行CE根治術治療，術前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療。其中男42例、女18例，年齡(59.37±9.13)歲，通過手術切除腫瘤組織及距腫瘤組織4 cm的正常組織制作石蠟標本。

1.2 ESCC組織及癌旁正常組織VEGF-C、VEGF-D表達檢測 采用免疫組化法。取ESCC組織及癌旁正常組織標本，包埋、切片脫蠟至水、抗原修復、3%過氧化氫孵育、山羊血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、辣根酶標記、DAB顯色、蘇木素復染及脫水、透明、封片、鏡檢。VEGF-C和VEGF-D陽性細胞染色呈淺黃色至棕黃色，定位于細胞質內，以陽性細胞百分比≥30%為陽性表達。采用Image-proplus 6.0軟件分析5個視野的光密度值，以平均光密度值作為VEGF-C、VEGF-D的相對表達量。

1.3 ESCC組織微血管密度(MVD)、微淋巴管密度(MLVD)測算 采用免疫組化法。CD31蛋白染色陽性定位于血管內膜，呈現黃色至棕黃色顆粒。以CD31染色陽性的單個內皮細胞或內皮細胞簇作為一個單獨的可數微血管。低倍鏡下定位血管高密度區域，高倍鏡下隨機計數5個視野微血管數量，計算平均值即為MVD[6]。D2-40染色陽性定位于腫瘤內淋巴管中，呈棕黃色，D2-40染色陽性的單個內皮細胞或內皮細胞簇為一個陽性微淋巴管，低倍鏡下尋找D2-40染色陽性密集區域，高背景下隨機選擇5個視野計數微淋巴管數量，以其平均值作為MLVD[7]。

2 結果

2.1 ESCC組織及癌旁正常組織中VEGF-C、VEGF-D表達比較 ESCC組織及癌旁正常組織VEGF-C陽性表達率分別為68.33%(41/60)、7.14%(4/60)，VEGF-D陽性表達率分別為56.67%(34/60)、3.45%(2/60)，ESCC組織與癌旁正常組織中VEGF-C、VEGF-D的陽性表達率比較差異有統計學意義(P均<0.05)。ESCC組織及癌旁正常組織中VEGF-C相對表達量分別為0.250±0.043、0.074±0.046，VEGF-D相對表達量分別為0.241±0.028、0.075±0.045，ESCC組織與癌旁正常組織VEGF-C、VEGF-D相對表達量比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

2.2 VEGF-C、VEGF-D表達水平與ESCC患者臨床病理參數的關系 VEGF-C、VEGF-D表達水平與ESCC淋巴結轉移、臨床分期有關(P均<0.05)，VEGF-C表達水平還與腫瘤浸潤深度有關(P<0.05);二者與性別、年齡、腫瘤分化程度和浸潤深度無關(P均>0.05)。見表1。

2.3 ESCC組織中VEGF-C、VEGF-D表達與MLVD、MVD的關系 ESCC組織中VEGF-C、VEGF-D表達與MLVD、MVD的關系見表2。經Spearman等級相關分析發現，ESCC組織中VEGF-C表達水平與MLVD、MVD呈正相關(r分別為0.521、0.561，P均<0.05)；VEGF-D表達水平與MLVD呈正相關(r=0.660，P<0.05)，與MVD無相關性(r=0.212，P>0.05)。

2.4 VEGF-C、VEGF-D表達水平與ESCC患者預后的關系 60例患者術后1年出現腫瘤復發或轉移24例。術后復發轉移患者ESCC組織中VEGF-C、VEGF-D相對表達量(0.274±0.049、0.252±0.032)高于術后無復發轉移患者(0.183±0.034、0.189±0.011)，比較差異有統計學意義(P均<0.05)。

表1 VEGF-C、VEGF-D表達水平與ESCC患者臨床病理參數的關系±s)

表2 ESCC組織中VEGF-C、VEGF-D表達與MLVD、MVD的關系

2.5 ESCC淋巴結轉移的影響因素 經Logistic回歸分析發現，VEGF-C、VEGF-D陽性表達及腫瘤浸潤程度(OR分別為8.321、7.683、0.104，P均<0.05)是ESCC患者淋巴結轉移的影響因素。

3 討論

ESCC早期可通過淋巴管擴散到局部淋巴結。VEGF家族中的VEGF-C被認為能夠促進腫瘤新生血管生成。VEGF-C和VEGF-D是主要的淋巴管生成因子，在腫瘤淋巴管生成中起重要作用[8]。VEGF-C在結直腸癌、胃癌等多種消化道腫瘤組織中高表達，并被認為與腫瘤的浸潤程度、淋巴管侵犯及淋巴結轉移密切相關。VEGF-C在頭頸部鱗癌組織中高表達，被認為可促進新生血管生成及淋巴管增生[9]。在非小細胞肺癌[10]、乳腺癌[11]、黑色素瘤[12]等實體腫瘤組織中均發現VEGF-C蛋白表達明顯高于相應部位的正常組織或癌旁正常組織，且其表達水平與淋巴管形成、淋巴結轉移及預后密切相關。在現有的研究中，多數支持VEGF-D與多種惡性腫瘤淋巴管生成和淋巴道轉移相關。VEGF-D不但可促進腫瘤內部的淋巴管生成，而且可誘導腫瘤細胞向淋巴結擴散，VEGF-D的特異性抗體可阻斷這種淋巴道播散。VEGF-D在口腔鱗癌中的表達高提示腫瘤的淋巴結轉移率較高[13]。對胃癌的研究表明，VEGF-D的陽性表達與胃癌的淋巴結轉移顯著相關[14]，這種相關性甚至出現在早期的淋巴結微轉移中。本研究不僅用了傳統的陽性表達率來定性表述VEGF的表達情況，還聯合應用光密度值來定量描述其表達情況，使結果更加具有說服力。本研究發現，ESCC腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-D的陽性表達率和相對表達量均高于癌旁正常組織，該結果說明VEGF-C、VEGF-D促進了ESCC的發生發展。

腫瘤組織的淋巴管形成是一個涉及淋巴管內皮細胞、細胞外基質及包括腫瘤細胞在內的多因素、多步驟的復雜過程。本研究發現，在ESCC組織中，VEGF-C、VEGF-D的表達水平與有無淋巴轉移、臨床分期以及有無復發轉移密切相關，在有淋巴結轉移、臨床分期較晚及術后復發轉移的ESCC組織中，VEGF-C、VEGF-D具有較高的表達水平；同時，本研究選用D2-40單克隆抗體對ESCC組織的MLVD進行定量檢測，在ESCC組織中，VEGF-C、VEGF-D表達水平與MLVD均呈正相關。以上結果證實VEGF-C、VEGF-D是腫瘤淋巴管生成的誘導劑，促進了淋巴管的生成。且VEGF-C表達水平還與MVD呈正相關，說明VEGF-C還與腫瘤浸潤程度有關。復發與轉移是癌癥的主要特征。也是腫瘤患者預后的重要不利因素，在Logistic回歸分析中發現，VEGF-C、VEGF-D陽性表達以及腫瘤浸潤程度是ESCC術后復發轉移的獨立影響因素，能夠預測患者的術后預后狀態。

綜上所述，VEGF-C、VEGF-D在ESCC組織中的表達水平升高，促進了ESCC的腫瘤發生發展，并且參與了腫瘤組織中的淋巴管生成，與ESCC的淋巴轉移密切相關，可以作為患者預后的重要依據。

[1] 莊璐,馬丹.食管癌危險因素研究進展[J].胃腸病學和肝病學雜志,2015,24(9):1141-1145.

[2] Siegel R, Naishadham D, Jemal A. Cancer statistics,2013[J]. CA Cancer J Clin, 2013,63(1):11-30.

[3] 李京佳,林相國,許濤,等.VEGF家族及其在腫瘤生長中作用的研究[J].現代生物醫學進展,2012,12(4):777-779,701.

[4] 劉建平,張永恒,付茂勇,等.VEGF-C 與食管鱗癌淋巴管生成的研究進展[J].現代腫瘤醫學,2015,23(9):1315-1318.

[5] 楊進,馬水根,徐朝軍,等.食管鱗狀細胞癌中HDGF、VEGF表達與微血管形成的關系[J].現代生物醫學進展,2014,14(30):5956-5959.

[6] 王偉,胡冰,何義富,等.食管癌血管生成的研究進展[J].國際腫瘤學雜志,2014,41(1):31-34.

[7] 馬俊,繆蓉,魯建軍,等.血管內皮生長因子A在食管鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義[J].廣西醫學,2014,36(9):1253-1255.

[8] 張偉,任鳳云,金丹,等.血管內皮生長因子-D表達與非小細胞肺癌淋巴管生成和淋巴結轉移的相關性[J].中國老年學雜志,2014,34(11):2917-2920.

[9] 鄧蒞霏,齊淑軼,劉學明,等.VEGF-C及癌周淋巴管密度與頭頸鱗癌頸部淋巴結轉移的關系[J].實用癌癥雜志,2012,27(6):565-567,585.

[10] 張利斌,王平,熊健,等.非小細胞肺癌中VEGF-C、VEGF-D、VEGFR-3表達與微淋巴管密度的關系[J].安徽醫科大學學報,2013,48(8):933-937.

[11] Li X, Dang X, Sun X. Expression of survivin and VEGF-C in breast cancer tissue and its relation to lymphatic metastasis[J]. Eur J Gynaecol Oncol, 2012,33(2):178-182.

[12] 殷芳,宋寧靜,王曉楠,等.STAT3和VEGF在皮膚黑素瘤中的作用及研究進展[J].國際皮膚性病學雜志,2013,39(1):28-31.

[13] 劉英,莫金龍,劉震,等.VEGF-D在口腔鱗癌相關成纖維細胞的表達研究[J].川北醫學院學報,2014,29(4):330-334.

[14] 李開智,劉飛飛,王翠玲,等.淋巴管新生與胃癌淋巴道轉移的關系[J].海南醫學,2015,26(22):3391-3393.

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.031

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1002-266X(2016)37-0090-03

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