轉染人源Omentin-1、Vaspin妊娠期糖尿病脂肪細胞胰島素受體底物和磷脂酰肌醇3激酶表達變化

潘寶龍，馬潤玫

(昆明醫科大學，昆明 650031)

?

轉染人源Omentin-1、Vaspin妊娠期糖尿病脂肪細胞胰島素受體底物和磷脂酰肌醇3激酶表達變化

潘寶龍，馬潤玫

(昆明醫科大學，昆明 650031)

目的 觀察轉染人源網膜素1(Omentin-1)、內臟脂肪組織源性絲氨酸蛋白酶抑制劑(Vaspin)的妊娠期糖尿病(GDM)脂肪細胞胰島素受體底物1/2(IRS-1/2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)表達變化。方法 復蘇、傳代及誘導分化GDM前脂肪細胞。構建Omentin-1、Vaspin過表達載體，以3個不同過表達梯度(1.0、2.5、5.0 μg)轉染傳代脂肪細胞，以無轉染組為對照。采用實時熒光定量PCR法檢測各組脂肪細胞Omentin-1、Vaspin、IRS-1/2、PI3K mRNA；采用Western blotting法檢測各組脂肪細胞Omentin-1、Vaspin、IRS-1/2、PI3K蛋白及酪氨酸磷酸化IRS-1/2；采用[3H]-2-脫氧-D-葡萄糖攝取測定法測算各組脂肪細胞葡萄糖的攝取率。結果 隨Omentin-1表達增加，轉染人源Omentin-1脂肪細胞中IRS-1、PI3K(P85a)mRNA及蛋白表達增加，IRS-2 mRNA及蛋白表達未發生明顯變化，IRS-1酪氨酸磷酸化程度明顯升高，IRS-2酪氨酸磷酸化程度未發生明顯變化，葡萄糖攝取率上升。隨Vaspin表達增加，轉染人源Vaspin脂肪細胞IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)mRNA及蛋白表達均未出現明顯變化，IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化程度均未出現明顯變化，葡萄糖攝取率變化不明顯。 結論 轉染人源Omentin-1的GDM脂肪細胞IRS-1和PI3K(P85a)表達升高，葡萄糖攝取率升高；轉染人源Vaspin的GDM脂肪細胞無此變化。

妊娠期糖尿病；網膜素1；內臟脂肪組織源性絲氨酸蛋白酶抑制劑；基因轉染；胰島素抵抗；胰島素受體底物1；胰島素受體底物2；磷脂酰肌醇3激酶

妊娠期糖尿病(GDM)是在妊娠期首次發生或發現的糖尿病，嚴重威脅孕婦及其子代健康。至今為止GDM病因不明，眾多研究[1,2]一致認為是多種因素共同作用的結果。胰島素抵抗被認為是GDM的始發因素，是目前公認的GDM發病的病理生理基礎之一，而胰島素信號通路異常是發生胰島素抵抗的主要原因[3,4]。近年來，來源于脂肪組織的脂肪因子與GDM的關系倍受關注，已成為新的研究熱點[5,6]。課題組前期研究發現，在GDM患者血清及體內網膜脂肪組織中，網膜素1(Omentin-1)出現了明顯的低表達，而內臟脂肪組織源性絲氨酸蛋白酶抑制劑(Vaspin)出現了明顯高表達，提示兩者可能與GDM的胰島素抵抗存在關聯。本研究觀察了轉染人源Omentin-1、Vaspin的GDM脂肪細胞胰島素受體底物1/2(IRS-1/2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)表達變化，IRS-1/2酪氨酸磷酸化水平的變化，以及細胞葡萄糖攝取率的變化，探討脂肪因子Omentin-1、Vaspin與GDM胰島素抵抗的內在聯系，為研究GDM發病機理和治療策略提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料 高糖杜爾液體培養基(HG-DMEM)及6孔細胞培養板(美國Hyclone)，蛋白酶抑制劑(美國Merckmi Lipore)，蛋白上樣緩沖液(上海Beyotime)，聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，0.45 μm，德國Millipore)，人源Omentin-1及Vaspin過表達載體(廣州復能基因公司)。Thermo CO2培養箱，AIRTECH超凈工作臺，上海菁華紫外分光光度計(752)，美國ABI RT-PCR儀，ABI 96孔定量PCR板，BIO-RAD電泳儀(164-5050)。

1.2 人前脂肪細胞獲取及傳代培養 GDM患者大網膜前脂肪細胞的獲取符合人體試驗倫理學標準，經昆明醫科大學倫理委員會批準，獲得患者的知情同意。將凍存細胞從液態氮中取出，進行復蘇和傳代，前脂肪細胞獲取及上述具體操作方法見課題組報道文獻。

1.3 Omentin-1、Vaspin過表達載體構建及轉染 由廣州復能基因公司協助構建(Omentin-1序列號EX-W1410-Lv105，Vaspin序列號EX-E0540-Lv105)。培養和篩選STBL3大腸桿菌單克隆菌株，經震蕩培養和0.2 mL冰冷氯化鈣懸浮，將其制作為感受態細胞。分別取1 μL上述質粒，加至制好的感受態細胞中，按照課題組報道文獻完成質粒轉化、篩選陽性克隆及進一步擴大培養過程。使用粒抽提試劑盒(美國TIANGEN)，按照說明書抽提得到過表達載體Omentin-1(0.495 μg/μL)，Vaspin(0.601 μg/μL)。誘導GDM人源第3代傳代前脂肪細胞，待其分化為成熟脂肪細胞后，將Omentin-1和Vaspin過表達載體分別按照0.0、1.0、2.5、5.0 μg共4個濃度梯度進行轉染。每個濃度轉染6孔。

1.4 GDM脂肪細胞Omentin-1、Vaspin、IRS-1、IRS-2、PI3K mRNA檢測 上述細胞轉染48 h后，提取細胞總蛋白和總RNA，用實時熒光定量PCR法分別檢測Omentin-1、Vaspin、IRS-1、IRS-2、PI3K的mRNA。將定量PCR 96孔板置于冰上，總反應體系為20 μL(相應上下游引物各1 μL、RNA 1 μL、參比染料ROX 10 μL、蒸餾水7 μL)，使用ABI RT-PCR儀，反應條件為95 ℃變性1 min，85 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35個循環。結果判讀：2-ΔΔCt計算各樣本相對拷貝值。以0.0 μg時為對照(設為1.00)，其余各濃度以均值的比值表示。

1.5 GDM脂肪細胞Omentin-1、Vaspin、IRS-1、IRS-2、PI3K蛋白檢測 采用Western blotting法。細胞裂解液提取法提取細胞總蛋白，沸水浴5 min變性，BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)測定樣品中蛋白含量，計算出相應加樣量。根據目的蛋白分子量大小選擇和配制合適的SDS-PAGE分離膠和濃縮膠；加樣，120 V電泳，待溴酚藍泳至距離玻璃板下端1 cm位置停止，恒流300 mA轉膜(PVDF膜)，120 min，5%的牛血清白蛋白室溫封閉30 min；將切下的膜室溫孵育一抗60 min，PBS洗3次，室溫孵育二抗60 min；晾干PVDF膜，進行顯影和定影，球面積分掃描儀檢測。以β-actin條帶為對照(設為1.00)，目標蛋白測定值=待測條帶/β-actin。

1.6 GDM脂肪細胞酪氨酸磷酸化IRS-1、IRS-2檢測 Western blotting法觀察轉染后脂肪細胞中的IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化水平。操作步驟基本同1.5。

1.7 GDM脂肪細胞葡萄糖的攝取率計算 脂肪細胞轉染48 h后以[3H]-2-脫氧-D-葡萄糖攝取測定法檢測葡萄糖攝取率，液體閃爍計數器計數細胞分鐘衰變數，BCA法檢測蛋白濃度。[3H]-2DG攝取率=計數分鐘衰變數×2/蛋白濃度。

2 結果

2.1 不同濃度人源Omentin-1、Vaspin轉染后GDM脂肪細胞Omentin-1、Vaspin mRNA及蛋白相對表達量 轉染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Omentin-1脂肪細胞Omentin-1 mRNA相對表達量分別為1.00、34.11、207.72、1 104.35，蛋白相對表達量分別為0.94、1.99、2.91、4.54。轉染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Vaspin脂肪細胞Vaspin mRNA相對表達量分別為1.00、7.44、1 105.78、9 543.26，蛋白相對表達量分別為0.91、2.47、4.39、4.97。

2.2 不同濃度人源Omentin-1、Vaspin轉染后GDM脂肪細胞IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)的mRNA、蛋白相對表達量 見表1。

表1 不同濃度人源Omentin-1、Vaspin轉染后GDM脂肪細胞IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)的mRNA、蛋白相對表達量

2.3 不同濃度人源Omentin-1、Vaspin轉染后GDM脂肪細胞IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化程度 轉染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Omentin-1脂肪細胞酪氨酸磷酸化IRS-1水平分別為0.56、0.72、1.51、2.34，IRS-2磷酸化水平分別為1.19、1.04、1.14、0.97。轉染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Vaspin脂肪細胞酪氨酸磷酸化IRS-1水平分別為0.88、0.79、0.86、0.91，酪氨酸磷酸化IRS-2水平分別為0.92、0.96、0.89、0.87。

2.4 不同濃度人源Omentin-1、Vaspin轉染后GDM脂肪細胞葡萄糖攝取率 轉染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Omentin-1脂肪細胞葡萄糖攝取率分別為1.00、1.21、1.26、1.44，轉染0.0、1.0、2.5、5.0 μg Vaspin脂肪細胞葡萄糖攝取率分別為1.00、0.97、0.97、1.01。

3 討論

因涉及醫學倫理學原因，目前對于基因過表達與疾病的關系研究多以體外實驗方式進行，尤其對于人脂肪細胞的研究，更多的是采用了小鼠3T3-L1前脂肪細胞[7,8]。嚙齒類動物與人類存在明顯的遺傳學差異，且兩者之間的代謝途徑也迥然不同，因此，將其作為實驗載體往往難以避免潛在的實驗缺陷問題，從而影響數據和結論的科學性[9]。課題組在前期成功建立了GDM網膜脂肪細胞原代培養及增殖分化模型，以人源細胞作為研究載體進行后續有關GDM方面的研究更具科學性。并且，以取自GDM網膜組織而培養傳代的前脂肪細胞，可能更多地保留了GDM其他的一些基因信息，更真實地模擬了GDM基因環境，使結果更具有說服力。這也是本課題得以順利進行的基礎條件和特點之一。

本研究采用大腸桿菌表達系統，對得到的過表達載體分別以低(1.0 μg)、中(2.5 μg)、高(5.0 μg)3個濃度梯度轉染GDM脂肪細胞，而后以實時熒光定量PCR和Western blotting驗證相應mRNA及蛋白表達，發現mRNA及蛋白表達水平均隨著過表達載體濃度增加而增加，充分說明所構建GDM網膜脂肪細胞原代培養及增殖分化模型真實有效，具有正常生理功能和表達能力，且所構建Omentin-1、Vaspin過表達載體有效，隨梯度增加而表達增加。

目前眾多研究理論認為，胰島素抵抗主要由受體后信號傳導的異常引起[10,11]。胰島素受體的信號傳導主要經過兩個途徑，即磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)途徑和Ras-絲分裂原激活的蛋白激酶(Ras-MAPK)途徑。PI3K途徑是胰島素受體信號傳導的經典途徑，也是胰島素對代謝調節的主要途徑，主要作用于葡萄糖攝取，糖原合成和降解的調節；Ras-MAPK途徑主要與基因轉錄的調控有關，主要作用于細胞生長和分化的調節[12,13]。兩條途徑相互獨立，在一定條件下，也能相互激活。其中，IRS是胰島素信號通路的關鍵物質。目前已發現的IRS分子包括四個亞型(IRS-1、IRS-2、IRS-3、IRS-4)。IRS-1是胰島素信號傳導的“船塢”蛋白，目前研究[14]認為IRS-1的表達可能與具有2型糖尿病家族史的患者密切相關，IRS-1表達不足或者磷酸化異?？蓪е乱葝u素抵抗。IRS-2在胰島素抵抗、2型糖尿病的發生中起著極其重要的作用，一旦IRS-2的表達出現異常，機體將很快出現糖尿病樣癥狀[15]。基于上述理論，本研究對Omentin-1、Vaspin與GDM胰島素PI3K信號傳導途徑的關系進行研究。

Omentin分為Omentin-1、Omentin-2，Omentin-1由網膜脂肪組織中的血管基質細胞分泌入血，或作用于周圍脂肪細胞發揮其生物學作用。有體外實驗報道，重組Omentin-1可促進皮下及網膜脂肪細胞對葡萄糖的攝取，提高胰島素敏感性，是胰島素“增敏因子”，但具體機制尚不明確[16]。本課題組先前研究發現，隨孕婦體質量增加(BMI值越高)及胰島素抵抗指數(HOMA)升高，血清Omentin-1水平不斷下降，Omentin-1水平與胰島素抵抗程度呈反比。本研究發現隨Omentin-1濃度增加，轉染人源Omentin-1脂肪細胞中IRS-1、PI3K(P85a)mRNA及蛋白表達增加，IRS-2 mRNA及蛋白表達未發生明顯變化，IRS-1磷酸化程度明顯升高，IRS-2磷酸化程度未發生明顯變化，葡萄糖攝取率上升。結合課題組前期研究可以認為，Omentin-1與GDM胰島素抵抗存在緊密的聯系，是機體的保護因子，對肥胖、糖尿病等具有拮抗作用，Omentin-1的表達可能通過某種途徑激活了IRS-1/PI3K(P85a)信號通路，間接導致了IRS-1和PI3K的活化和表達，并且促進了IRS-1的磷酸化，從而提高脂肪細胞對葡萄糖的攝取，發揮其胰島素增敏作用，而與IRS-2沒有明顯關系。

近年來一些研究認為，Vaspin是與肥胖、胰島素抵抗及2型糖尿病密切相關的脂肪因子之一。2型糖尿病患者由于存在胰島素抵抗，血糖水平不斷增高，血糖的升高可刺激脂肪組織分泌更多Vaspin來提高胰島素敏感性[17,18]。正常妊娠孕婦血清Vaspin水平則與胰島素敏感指數無關，GDM對孕婦血清Vaspin水平無影響[19]。課題組前期研究發現產前BMI、TG、FPG、OGTT 2 h是GDM患者血清Vaspin水平的獨立預測因子。本研究發現，隨Vaspin濃度增加，轉染人源Vaspin脂肪細胞IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)mRNA及蛋白表達均未出現明顯變化，IRS-1、IRS-2酪氨酸磷酸化程度均未出現明顯變化，葡萄糖攝取率變化不明顯。認為Vaspin與GDM胰島素信號傳導通路受體下游分子IRS-1、IRS-2、PI3K(P85a)不存在明顯關聯，Vaspin的升高并不會導致胰島素抵抗及GDM的發生。Vaspin在GDM血清及網膜脂肪組織中的高表達，很可能只是一種肥胖、GDM糖脂代謝紊亂的補償機制，僅作為一種肥胖及糖脂代謝紊亂的“生物學標志”，與GDM的胰島素抵抗的發生沒有必然聯系。

[1] Murphy A, Shamshirsaz A, Markovic D, et al.Urinary Excretion of Myo-Inositol and D-Chiro- Inositol in Early Pregnancy Is Enhanced in Gravidas With Gestational Diabetes Mellitus[J]. Reprod Sci, 2016,23(3):365-371.

[2] Farren M, Daly N, O′Higgins AC, et al. The interplay between maternal obesity and gestational diabetes mellitus[J]. J Perinat Med, 2015,43(3):311-317.

[3] Perez-Perez A, Guadix P, Maymo J, et al. Insulin and Leptin Signaling in Placenta from Gestational Diabetic Subjects[J]. Horm Metab Res, 2016,48(1):62-69.

[4] Westermeier F, Salomon C, Farias M, et al. Insulin requires normal expression and signaling of insulin receptor A to reverse gestational diabetes-reduced adenosine transport in human umbilical vein endothelium[J]. Faseb J, 2015,29(1):37-49.

[5] Wurst U, Ebert T, Kralisch S, et al. Serum levels of the adipokine Pref-1 in gestational diabetes mellitus[J]. Cytokine, 2015,71(2):161-164.

[6] Ma Q, Fan J, Wang J, et al. High levels of chorionic gonadotrophin attenuate insulin sensitivity and promote inflammation in adipocytes[J]. J Mol Endocrinol, 2015,54(2):161-170.

[7] 聶緒強,楊建文,史海霞,等.IR-3T3-L1脂肪胰島素抵抗細胞的建立[J].南方醫科大學學報，2015,35(1):103-108.

[8] Wang C, Wang L, Li W, et al. Irisin has no effect on lipolysis in 3T3-L1 adipocytes or fatty acid metabolism in HepG2 hepatocytes[J]. Endocrine, 2015,49(1) :90-96.

[9] Abuna RP, De Oliveira FS, Santos Tde S, et al. Participation of TNF-alpha in Inhibitory Effects of Adipocytes on Osteoblast Differentiation[J]. J Cell Physiol, 2016,231(1):204-214.

[10] Ou DL, Lee BS, Lin LI, et al. Vertical blockade of the IGFR-PI3K/Akt/mTOR pathway for the treatment of hepatocellular carcinoma: the role of survivin[J]. Mol Cancer, 2014,13(2):101-109.

[11]Hu F, Liu F. Targeting tissue-specific metabolic signaling pathways in aging: the promise and limitations[J]. Protein Cell, 2014,5(1) :21-35.

[12] Perrin AJ, Gunda M, Yu B, et al. noncanonical control of celegans germline apoptosis by the insulin/igf-1 and ras/mapk signaling pathways[J]. Cell Death Differ, 2013,20(1):97-107.

[13] Leiria LO, Sollon C, Bau FR, et al. insulin relaxes bladder via pi3k/akt/enos pathway activation in mucosa: unfolded protein response-dependent insulin resistance as a cause of obesity-associated overactive bladder[J]. J Physiol, 2013,591(9):2259-2273.

[14] Law NC, Hunzicker-Dunn ME. Insulin Receptor Substrate 1: The Hub Linking Follicle-stimulating Hormone to Phosphatidylinositol-3 Kinase Activation[J]. J Biol Chem, 2015,591(3):1047-1054.

[15] Roncero I, Alvarez E, Acosta C, et al. insulin-receptor substrate-2 ( irs-2) is required for maintaining glucokinase and glucokinase regulatory protein expression in mouse liver[J]. PLoS One, 2013,8(4):e58797.

[16] Greulich S, Chen WJ, Maxhera B, et al. cardioprotective properties of omentin-1 in type 2 diabetes: evidence from clinical and in vitro studies[J]. PLoS One, 2013,8(3):e59697.

[17] Tomasz S, Dominika S, Iwona KS, et al. Long-term Effect of Ileal Transposition on Adipokine Serum Level in Zucker (Orl)-Lepr(fa) Fatty Rats[J]. Obes Surg, 2015,25(10):1848-1857.

[18] Gkiomisi A, Makedou KG, Anastasilakis AD, et al. serum vaspin levels in women with and without gestational diabetes mellitus during pregnancy and postpartum[J]. Cytokine, 2013,61(1):127-132.

[19] Mm WQ, Fan J, Khor S, et al. Serum vaspin levels and vaspin mRNA expression in subcutaneous adipose tissue in women with gestational diabetes mellitus[J]. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol, 2014,182(2):98-101.

Expression changes of IRS-1/2 and PI3K in GDM adipocyte cells after anthropogenic Omentin-1, Vaspin transfection

PANBaolong,MARunmei

(KunmingMedicalUniversity,Kunming650031,China)

Objective To observe the expression changes of insulin receptor substrate-1/2 (IRS-1/2) and phosphatidy inositol 3 kinase (PI3K) in gestational diabetes mellitus (GDM) adipocyte cells after anthropogenic Omentin-1, visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor (Vaspin) transfection. Methods Recoveried, extended and differentiated GDM preadipocyte cells were prepared, and then we built Omentin-1, Vaspin overexpression carrier, and transfected the extended adipose cells with different overexpression levels (1.0, 2.5 and 5.0 μg). Meanwhile, no transfection group was taken as the contrast. Using Q-PCR to detect the mRNA expression of Omentin-1, Vaspin, IRS-1/2 and PI3K (P85a), using Western blotting to detect protein expression of Omentin-1, Vaspin, IRS-1/2 and PI3K (P85a) as well as IRS-1/2 phosphorylation levels, using [3H]-2 -deoxidation-D-glucose uptake assay to detect the rates of glucose uptake in different transfection groups. Results With the increasing Omentin-1 expression, the mRNA and protein expression of IRS-1 and PI3K(P85a) were increased, but those of IRS-2 had no significant changes, IRS-1 phosphorylation increased obviously, IRS-2 phosphorylation had no significant changes, and the glucose uptake rate increased significantly. With the increasing Vaspin expression, all of the mRNA, protein and phosphorylation in IRS-1/2 and PI3K(P85a) had no significant changes, so did the glucose uptake rates. Conclusion In GDM adipocyte cells after anthropogenic Omentin-1 transfection, IRS-1, PI3K(P85a) and glucose uptake rates were increased, but no changes in those of GDM adipocyte cells after anthropogenic Vaspin transfection.

gestational diabetes mellitus; Omentin-1; visceral adipose tissue-derived serine protease inhibitor; gene transfection ; insulin resistance; insulin receptor substrate-1; insulin receptor substrate-2; phosphatidy inositol 3 kinase

國家自然科學基金資助項目(81160082)。

潘寶龍(1973-)，男，副主任，副教授，主要從事圍產醫學的研究。E-mail: pbl1210@126.com

簡介：馬潤玫(1962-)，女，主任，教授，主要從事圍產醫學的研究。E-mail: pbl6916@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.003

R714.24

A

1002-266X(2016)35-0009-04

2016-06-12)