雪菊黃酮對脂肪變肝細胞的降脂效果

方煊，李雅麗，陳新梅

（1.紹興第二醫院 普外科，浙江 紹興 312000；2.新疆醫科大學附屬第一醫院 VIP內科，新疆 烏魯 木齊 830054；3.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355）

雪菊黃酮對脂肪變肝細胞的降脂效果

方煊1，李雅麗2，陳新梅3

（1.紹興第二醫院 普外科，浙江 紹興 312000；2.新疆醫科大學附屬第一醫院 VIP內科，新疆 烏魯 木齊 830054；3.山東中醫藥大學 藥學院，山東 濟南 250355）

目的：研究雪菊黃酮對發生脂肪變的正常人肝細胞系L-02的影響。方法：醫用脂肪乳注射液制備人肝L-02細胞的高脂細胞模型。以不同濃度（20、50、100 μmol/L）的雪菊黃酮進行共培養，分別孵育高脂變性的肝細胞不同時間（3、12、24、48 h）后，用油紅脂肪染色法觀察細胞脂滴形成情況。檢測細胞培養上清內的酶學指標谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、γ-谷氨酰轉肽酶（γ-GT）及甘油三酯（TG）的含量。結果：醫用脂肪乳培育人肝L-02細胞脂肪變性模型可行。高濃度的雪菊黃酮（100 μmol/L）培養后高脂肝細胞胞漿內脂滴明顯減少，TG含量降低。不同孵育時間培育（3、12、24、48 h）后，TG含量隨培育時間延長而逐步降低。結論：雪菊黃酮能降低脂肪變性肝細胞中TG的含量，作用效果與雪菊黃酮的作用濃度和培育時間相關，未見明顯肝細胞酶學損害。

雪菊；黃酮；甘油三酯；高脂細胞模型

本課題組前期進行了雪菊黃酮的制備、成分分離鑒定和分析工作，并進行了小鼠調脂作用分析[1]，初步證明雪菊黃酮具有降低小鼠血脂的作用，其作用機制尚不清楚。前期研究主要采用的是動物模型，存在個體差異較大、實驗條件不好控制、周期較長、材料耗費較多等缺點。而細胞模型實驗不僅能針對性地研究細胞水平的脂肪肝發病機制，并且能精確控制用藥濃度，研究分子作用機制，有效地縮短篩選治療藥物的進程，有助于篩選大量的藥物。本研究采用脂肪乳作用于在體外培養的人正常肝細胞L-02細胞株的方式，建立脂肪肝的體外模型，結合油紅O染色觀察細胞內脂肪滴變化情況，來驗證該肝細胞是否產生脂肪變性，并觀察雪菊黃酮對脂肪變性肝細胞的作用，探索雪菊在高脂細胞模型上的作用及可能的分子機制。

1 材料和方法

1.1 雪菊黃酮 前期的研究[1]已完成了雪菊總黃酮提取物的制備和化學成分分析，通過對雪菊中主要成分的分離純化，采用乙醇提取、大孔樹脂精制工藝，獲得了雪菊總黃酮提取物（CTTFE），并采用 HPLC/DAD建立了雪菊提取物的多波長定性和定量分析方法，采用核磁測試、液相質譜聯用分析技術，鑒 定了雪菊中黃諾馬苷（CT01）、馬里苷（CT02）、奧卡 寧（CT04）等12種主要成分，其中10種主要成分為黃 酮類，化學結構見圖1。

圖1 雪菊黃酮的分離鑒定和主要成分

1.2 細胞培養方法 正常肝細胞株L-02培養到對數生長期，用6孔板接種，培養板內加入含5%胎牛血清、5%小牛血清的RPMI 1640培養液，細胞培養同時放入蓋玻片，使細胞貼壁在蓋玻片上附著貼壁生長。培養板放入飽和濕度孵育箱內培養，培養條件設置如下：溫度為37 ℃，氣體濃度為5% CO2。根據細胞生長情況，每2～3 d用0.25%的胰蛋白酶消化，進行傳代培養。

1.3 實驗設計 接種L-02細胞在細胞培養板上，孵育24 h，待細胞貼壁生長后，設立實驗組和高脂模型組，實驗組又分為雪菊黃酮低、中、高3個不同濃度給藥組（不同藥物濃度分別為20、50、100 μmol/L），分別用含脂肪乳的RPMI 1640培養液培養，每組均設3個平行孔，培養3 d，實驗重復3次。顯微鏡下觀察細胞內脂滴形成狀況。取細胞上清液，檢測肝細胞分泌在上清中的肝臟酶學指標和甘油三酯（triglyceride，TG）。

1.4 細胞內脂滴形成的觀察 將貼壁生長肝細胞的蓋玻片從6孔細胞培養板中取出，清洗3次，采用固定液（4%多聚甲醛）固定20 min。清洗細胞2次，異丙醇漂洗數秒。室溫下采用紅色染料（油紅O）染色10～15 min，蒸餾水終止染色，細胞內的中性脂肪可被染成桔紅色或紅色。顯微鏡下觀察各組細胞內脂滴形成情況。

1.5 細胞酶學指標和TG測定 在細胞培養板的各孔中收集細胞培養上清液，在檢驗科自動生化儀上（BIO-RAD）定量測定細胞培養上清液中的代謝酶及TG含量。1.6 統計學處理方法 采用SPSS15.0統計軟件進行分析。計量資料用±s表示，組間比采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脂肪染色觀察 雪菊100 μmol/L組脂肪染色后觀察，在顯微鏡下看到胞漿內脂滴與高脂模型組比較明顯減少，因此雪菊100 μmol/L組降脂效果最明顯。各實驗組細胞染色結果及分析結果見圖2。

2.2 不同雪菊黃酮濃度對降脂效果的影響 雪菊黃酮配制成雪菊100 μmol/L組、雪菊50 μmol/L組、雪菊20 μmol/L組3個濃度后加入培養液，孵育48 h 后測定肝臟酶學指標和TG，統計結果見表1。

2.3 不同孵育時間對降脂效果的影響 雪菊黃酮孵育3、12、24、48 h后檢測培養液體上清中TG，統計結果見表2。TG含量隨雪菊黃酮作用時間延長而相應降低，在48 h效果顯著（P＜0.01）。

3 討論

雪菊是一種藥食兩用植物，又稱為蛇目菊、雙色金雞菊，是新疆特色中草藥[1-2]，原產北美洲，在我國新疆和田地區高緯度昆侖山北麓一帶生長，新疆維醫稱作“古麗恰爾”（維吾爾語，意即花茶）[3]， 性味苦、辛，歸肺、肝經。《本草匯言》稱其可“破血疏肝，解疔散毒”。雪菊在新疆當地少數民族中作為茶飲使用多年，含有酮、生物堿、揮發性油、有機酸、皂井、氨基酸等多種藥理成分，已成為營養學家、藥理學家以及養生專家研究的熱點[4-9]。我們前期試驗采用柱層析法和質譜色譜聯用技術已從雪菊中分離鑒定出多種黃酮類物質，發現黃酮含量 很高[1]，可有效地清除體內的氧自由基，防止細胞的退化、衰老及癌變的發生[10]，也具有免疫調節的作用，是降血壓、降血脂、調節血糖、抗腫瘤與抗衰老相關藥物中的重要元素[11-13]。上述研究資料表明，雪菊具有較為確切的降血糖、降脂、降壓等功效，但一般采用雪菊提取物進行，缺乏對應的有效成分的分析和鑒定。此外，尚未見有關雪菊對非酒精性脂肪肝是否有保護作用的報道。

圖2 細胞染色結果及雪菊作用后脂肪滴減少的鏡下結果

表1 不同劑量雪菊黃酮對細胞培養液上清中酶學指標以及TG的影響（48 h）

表2 不同培養時間對細胞培養液上清中TG的影響

本研究探討了脂肪乳作用于在體外培養的人正常肝細胞L-02細胞株建立高脂細胞模型的可行性，建立脂肪肝的體外中藥篩選模型，結合油紅染色觀察細胞內脂肪滴變化情況，可以反映肝細胞產生脂肪變性的程度，并證實雪菊黃酮能夠減少脂肪變性肝細胞的脂滴，降脂作用呈現時間和劑量依賴性，為雪菊的藥物開發奠定了細胞學實驗基礎。

雪菊作為一種昆侖山特殊藥用植物，在民間作為茶飲已經有多年歷史，有一些觀察描述性論述，但 大多數的研究僅限于驗方使用，沒有進行嚴格的雪菊化學單體分離鑒定，缺乏嚴格對照，本研究采用質譜連用的現代藥物分離鑒定手段，對新疆雪線以上的雪菊進行單體分離，化學組分鑒定，在光譜和色譜測試指導下提取分離獲取雪菊特征總提物，采用植物化學的研究方法對特征總提物進行分離，得到各單體化合物，并鑒定了主要單體化合物的結構，在體外培養體系中研究了雪菊降脂藥效物質學基礎和作用機制。該研究采納了民間驗方和維醫為基礎，有利于提高雪菊提取的標準化，有助于推動雪菊的物質學基礎和藥效學研究。

中藥在治療慢性病方面有獨特的療效，是我國傳統醫學的瑰寶，目前各種中藥材都采用現代科學技術和方法證實藥物的有效性，并闡明其作用機 制[14-17]。而本研究采用植物化學、工業色譜等技術和方法，篩選雪菊核心成分，并且闡明雪菊降低肝臟細胞脂肪的作用機制和作用靶點，能夠提升地方特色藥材雪菊開發利用的效率，為雪菊藥物開發進行標準化生產奠定了實驗基礎。

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（本文編輯：趙翠翠）

Experimental study of flavonoids from Coreopsis tinctoria of lipid-lowering effect on liver cells

FANG

Xuan1, LI Yali2, CHEN Xinmei3. 1.Department of General Surgery, the Second Hospital of Shaoxing, Shaoxing, 312000； 2.Department of Internal Medicine VIP Ward, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi, 830054； 3.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Ji’nan, 250355

Objective: To study the lipid-lowering effect of flavonoids from Coreopsis tinctoria on the liver cells with fatty degeneration. Methods: The medical fat emulsion injection was used as fat resource to make human liver fat cell model on normal liver cell line L-02. With different concentrations (20, 50, and 100 μmol/L flavonoids from Coreopsis tinctoria were co-cultured with hepatocytes with fatty degeneration and incubated for different times (3, 12, 24, 48 h). The oil red staining was used to mark the intracellular lipid droplets and morphological changes. The cell culture supernatants were collected to test triglyceride content. Results: L-02 high fat cell model was feasible. High concentration of flavonoids (100 μmol/L) showed the significant decrease of lipid droplets and lower triglyceride levels. The triglyceride decreased with prolonged incubation time. Conclusion: Flavonoids from Coreopsis tinctoria can reduce triglyceride in the liver cells with fat degeneration. There is no significant liver cell enzyme damage. The effect depends on the concentration and incubation time.

Coreopsis tinctoria； flavonoid； triglyceride； fat degeneration

R93

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2016.10.004

2015-11-02

國家自然科學基金資助項目（81460634）；山東中醫藥

大學2013年“名科工程”青年骨干培養計劃課題（ZYDXY1337）； 新疆醫科大學自然科學基金資助項目（2013ZRZD07）。

方煊（1976-），男，浙江紹興人，副主任醫師，碩士。

陳新梅，副教授，Email：xinmeichen@126.com。