去鐵酮對大鼠腦出血后三價(jià)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)體及神經(jīng)功能的影響

尹永鋒， 王改青， 陳艷麗

鐵離子是腦出血后血紅蛋白的降解產(chǎn)物，可增強(qiáng)氧化應(yīng)激、促進(jìn)脂質(zhì)過氧化、損傷DNA和蛋白質(zhì)，在腦水腫形成、繼發(fā)性腦損害中起關(guān)鍵作用［1，2］。目前對腦出血的實(shí)驗(yàn)干預(yù)多采用去鐵胺［3～5］，經(jīng)胃腸吸收差，不能口服，而本實(shí)驗(yàn)采用分子量更小、親脂性高、血腦屏障透過率更好的去鐵酮［6］，以減少藥物不能及時到達(dá)病灶、發(fā)揮最大療效對實(shí)驗(yàn)的影響。去鐵酮是口服的鐵螯合劑，可特異性的結(jié)合三價(jià)鐵，促進(jìn)其從體內(nèi)排出［6］。目前國內(nèi)外關(guān)于去鐵酮干預(yù)腦出血后三價(jià)鐵相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體變化的研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察去鐵酮干預(yù)大鼠腦出血后鐵蛋白(Ft)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(TfR)的表達(dá)變化及神經(jīng)功能障礙的動態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 模型制備 選擇健康成年SD大鼠72只，雌雄各半，體重250～300 g，隨機(jī)分為假手術(shù)對照組(SH)、腦出血組(ICH)、去鐵酮組(DFP)，每組再分1 d、3 d、7 d、14 d 4 個亞組，每亞組6 只。采用大鼠Ⅳ型膠原酶(美國sigma)定位注射制造腦出血模型。大鼠稱重后以10%水合氯醛按300 mg/kg體重腹腔注射麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀(WDT-V型，中國產(chǎn))，使大鼠前后囟位于同一水平面，備皮、消毒、暴露前囟，于前囟右側(cè)旁開3.2 mm，前囟后1.2 mm處用骨鉆鉆一直徑約1 mm的小孔，用微量泵及微量注射器(上海高鴿)取配好的2.5 μl含0.5 UⅣ型膠原酶的溶液，于5 min注射于蒼白球(前囟后 1.2 mm 右側(cè)旁開 3.2 mm，深 5.6 mm)，注射完畢后留針15 min緩慢退出，無菌骨蠟封閉圓孔，縫合皮膚后消毒。SH組步驟相同，注入等量生理鹽水。術(shù)后24 h按Rosenberg評分法大于10分或斷頭取腦證實(shí)有血腫者入選實(shí)驗(yàn)［7］。未到各預(yù)定時間點(diǎn)死亡者或到時間點(diǎn)斷頭取腦未見血腫者剔除實(shí)驗(yàn)，重新造模補(bǔ)足實(shí)驗(yàn)數(shù)量。DFP組于術(shù)后24 h Dfp(加拿大奧貝泰克)灌胃125 mg/kg/次，1次/12 h(Q12 h)，SH組與ICH組術(shù)后24 h給予等量的生理鹽水灌胃Q12 h。

1.2 神經(jīng)功能評分 各組大鼠造模后正常飲食，按預(yù)定時間點(diǎn)根據(jù)Rosenberg評分法［7］進(jìn)行評分。

1.3 免疫組化染色 應(yīng)用兔抗Ft、Tf、TFR多克隆抗體(武漢博士德，稀釋比例1:150)、SABC免疫組化試劑盒(武漢博士德)。將石蠟標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟入水，用新鮮配制的3%H2O2液處理10 min，PBS洗5 min，3次，切片浸入0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)，電磁爐加熱至沸騰后斷電，冷卻至室溫后，PBS洗3次，加山羊血清封閉液(武漢博士德)，室溫20 min，甩去多余液體，滴加一抗，37℃孵育2 h;PBS洗5 min，3次;加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG(武漢博士德)，37 ℃孵育30 min，PBS 洗5 min，3 次;加 SABC，37℃孵育30 min，PBS洗5 min，3次;DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，包括正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)、LSD多重比較檢驗(yàn)、Dunnett’s T3多重比較檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)均采用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(χ±s)表示，顯著性水平 α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 與SH組比，ICH組、DFP組各時間點(diǎn)均增高，ICH組以1 d最高，3 d、7 d與1 d比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，于14 d有所下降，DFP組以1 d、3 d最高，之后逐漸下降，于14 d仍高于SH組，DFP組與同時間點(diǎn)ICH組比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

2.2 Ft免疫組化 SH組比，ICH組Ft免疫陽性細(xì)胞數(shù)于1 d無明顯變化，于3 d、7、14 d增多，以7 d最多;DFP組Ft免疫陽性細(xì)胞數(shù)也于3 d、7 d、14 d增多，變化趨勢相同，但增幅較ICH組小(見表2)。鏡下顯示Ft陽性細(xì)胞主要表達(dá)于血腫周圍的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中。

2.3 Tf免疫組化 與SH組比較，ICH組Tf免疫陽性細(xì)胞數(shù)于 1 d、3 d、7 d、14 d 增多，以 3 d 最多，7 d次之;DFP組Tf免疫陽性細(xì)胞數(shù)也于各時間點(diǎn)增高，但升高程度均低于ICH組(見表3)。鏡下顯示Tf陽性細(xì)胞多見于血腫周圍少突膠質(zhì)細(xì)胞胞漿或胞核內(nèi)。

2.4 TfR免疫組化 與SH比較，ICH組 TfR免疫陽性細(xì)胞數(shù)于1 d天開始增高，3 d、7 d達(dá)高峰，于14 d降至對照組水平;DFP組變化趨勢與之相同，但各時間點(diǎn)表達(dá)量均比ICH組少(見表4)。鏡下顯示TfR陽性細(xì)胞主要表達(dá)于血腫周圍的神經(jīng)元和脈絡(luò)叢內(nèi)皮細(xì)胞胞膜和胞漿。χ±s)

表1 不同組別、不同時間點(diǎn)大鼠神經(jīng)功能評分(n=6，χ±s，單位:分)

表2 不同組別、不同時間點(diǎn)血腫周圍Ft免疫陽性細(xì)胞數(shù)(n=6，χ±s)

表3 不同組別、不同時間點(diǎn)血腫周圍Tf免疫陽性細(xì)胞數(shù)(n=6，χ±s)

表4 不同組別、不同時間點(diǎn)血腫周圍TfR免疫陽性細(xì)胞數(shù)(n=6，

3 討論

正常情況下，體內(nèi)鐵在Ft、Tf、Tfr等作用下處于生理穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮其生理作用［8，9］。腦出血后腦組織內(nèi)鐵離子大量聚集參與了早期的腦損傷，可導(dǎo)致后期神經(jīng)系統(tǒng)變性［3，10～12］，故對鐵離子的有效清除是改善預(yù)后重要的手段之一。Dfp是三價(jià)鐵螯合劑，鞏泉泉［6］等發(fā)現(xiàn)去鐵酮在大鼠腦和睪丸中均可測出，說明其穿透力極強(qiáng)，可通過血腦屏障，有利于對腦組織內(nèi)鐵離子的有效清除。

腦組織將超過生理需要的鐵以Ft的形式儲存于神經(jīng)元內(nèi)，避免過多的鐵離子對自身組織的損害。研究表明［3，10］:Tf-Tfr通路是鐵通過毛細(xì)血管內(nèi)皮的主要通路。本實(shí)驗(yàn)顯示ICH組Ft主要表達(dá)于血腫周圍的神經(jīng)元細(xì)胞中，于3 d開始升高，7 d達(dá)高峰，到14 d仍高于正常;而Tf主要表達(dá)于血腫周圍的少突膠質(zhì)細(xì)胞中，Tfr主要表達(dá)于血腫周圍的神經(jīng)元和脈絡(luò)叢細(xì)胞中，兩者均從1 d開始升高，3～7 d達(dá)高峰，后逐漸下降?？梢酝茢嗄X出血后大量鐵離子的產(chǎn)生破壞了機(jī)體原有的鐵平衡狀態(tài)，機(jī)體為維持自身平衡而激活Fe-Tf-TfR通路，促進(jìn)鐵離子的外排，另一方面將其轉(zhuǎn)變?yōu)镕t儲存起來。Zhang、Jing等發(fā)現(xiàn)腦出血后有從腦跨過血腦屏障進(jìn)入血液的Tf，提示 Tf、TfR 可 能 參 與 鐵 超 載 的 清 除［13，14］。Jimin Wu［10］等發(fā)現(xiàn)Ft的上調(diào)是由鐵介導(dǎo)的，腦出血后Ft、Tf、TfR的上調(diào)有可能起神經(jīng)保護(hù)作用。

Dfp干預(yù)腦出血后，F(xiàn)、Tf、TfR的表達(dá)量較ICH組雖有所下降，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于SH組，提示Dfp可能通過及時有效的結(jié)合三價(jià)鐵減輕了機(jī)體的鐵負(fù)荷，進(jìn)而減輕了自身誘發(fā)維持鐵平衡機(jī)制的力度，但DFP組的神經(jīng)功能評分與同時間點(diǎn)ICH組比并無改善。鐵主要通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生活性氧激發(fā)氧化壓力，引起組織脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)氧化及DNA的破壞［15，16］。Fenton 反 應(yīng):Fe2++H2O2→ Fe3++OH-+OH-，腦出血后二價(jià)鐵是主要蓄積形式。其原因可能是Dfp有效的結(jié)合Fe3+使其減少，促進(jìn)了該反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致活性氧的形成增加從而抵消了清除Fe3+而帶來的益處。Auriat、Warkentin 等人［4，5］的研究也表明三價(jià)鐵螯合劑可降低總鐵含量但不能改善神經(jīng)功能障礙。

此外，在實(shí)驗(yàn)之初，Dfp劑量為400 mg/kg/次，大鼠在干預(yù)1 d即開始出現(xiàn)血尿、鼻腔出血、精神萎靡，3 d左右相繼死亡，改為200 mg/kg/次，上述癥狀稍有改觀，但仍于5 d左右相繼死亡，改為125 mg/kg/次后尚能完成實(shí)驗(yàn)。由此可見，Dfp的毒性過大限制了其使用劑量。本實(shí)驗(yàn)大鼠的神經(jīng)功能評分未能改善也許有一部分原因可歸咎于藥物使用劑量偏少。

總之，Dfp可降低腦出血后Ft、Tf、TfR表達(dá)上調(diào)的程度，不能改善神經(jīng)功能障礙，而腦出血后自身Ft、Tf、TfR的表達(dá)上調(diào)可能起神經(jīng)保護(hù)作用。使用二價(jià)鐵螯合劑也許可以在清除鐵超載的同時不促進(jìn)Fenton反應(yīng)進(jìn)行以減少活性氧的產(chǎn)生，這也許是改善腦出血預(yù)后的一個新的研究方向。

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